牛源无乳链球菌分离鉴定与耐药性分析

尹金花，李玫毅，吴 兴，贺建忠*

(1.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300；2.郑州市农业综合行政执法支队，河南郑州 450053)

无乳链球菌(Streptococcasagalactiae)是引起奶牛乳房炎的重要病原菌之一[1]。该菌具有一定的传染性，常定植于乳腺，主要引起隐性乳房炎的发生，导致SCC升高[2]。近年来，在我国多个地区的奶牛乳房炎乳样中均分离到无乳链球菌[3-4]。虽然抗菌类药物在奶牛乳房炎的防治中发挥了重要的作用，但抗生素的滥用使无乳链球菌产生耐药性，给奶牛乳房炎的治疗带来困难[5-6]。本研究采集阿拉尔市某奶牛场乳房炎乳样，用传统的细菌鉴定方法和现代分子生物学方法进行无乳链球菌的分离鉴定，并对鉴定的无乳链球菌进行药敏试验，以期为牛场制定合理有效的乳房炎防控策略提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品及菌株 样品为新疆阿拉尔市某牛场62份隐性奶牛乳房炎乳样。无乳链球菌ATCC13813标准菌株、金黄色葡萄球菌由塔里木大学重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、脑心浸液培养基(BHI)、MH(A)培养基、改良爱德华琼脂培养基、革兰氏染色试剂盒、脱纤维绵羊血，北京奥博星生物技术有限公司产品；2×Master Mix、DL 2000 Marker、细菌基因组提取试剂盒，北京全式金生物技术有限公司产品；细菌微量生化鉴定管、药敏纸片，杭州滨和微生物试剂有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；高压灭菌器，日本 Hirayama公司产品；PCR扩增仪、凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司产品；数码生物显微镜，尼康仪器(上海)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养及革兰染色 将乳样划线接种于含50 mL/L绵羊血的TSA平板上，37℃培养24 h。将疑似为链球菌的菌落接种于含50 mL/L绵羊血的TSA平板上和改良爱德华培养基进行纯化培养。挑取单菌落进行革兰染色镜检。

1.2.2 生化鉴定及触酶试验 挑取单菌落接种于含有葡萄糖、蔗糖、乳糖、马尿酸盐、七叶苷的微量生化鉴定管中，37℃恒温培养箱培养18 h～24 h，观察并记录结果。同时，在载玻片上滴1滴 3% H2O2，挑取单菌落与H2O2搅匀，进行触酶试验，产生气泡者判定为阳性。

1.2.3 CAMP试验 将金黄色葡萄球菌横线接种于含50 mL/L绵羊血平板，疑似链球菌与之垂直划线接种，距离0.5 cm，37℃恒温培养箱培养18 h～24 h，观察并记录。

1.2.4 PCR鉴定 将疑似链球菌单菌落接种于TSB培养基，37℃增菌培养后，按照细菌基因组提取试剂盒提取DNA，参照GenBank发表的cfb基因序列(Accession NO.NC-004116.1)，设计特异性引物，同时设计合成16S rRNA 通用引物(表1)，进行PCR扩增。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳，随后送上海生工生物工程科技有限公司完成测序。将基因序列与NCBI数据库进行Blast比对分析。

表1 PCR引物列表

1.2.5 药敏试验 以无乳链球菌质控菌株ATCC13813作为质控菌，采用KB纸片法，取0.5麦氏单位的25 μL菌液涂布于MH(A)培养基，选取青霉素、庆大霉素、万古霉素、氨苄西林、克林霉素、头孢哌酮、红霉素、环丙沙星、卡那霉素、阿莫西林-克拉维酸10种抗菌药敏片进行药敏试验。根据美国临床实验室标准委员会(CLSI)的标准进行判定结果。

2 结果

2.1 细菌分离培养及革兰氏染色

挑选在改良爱德华培养基生长良好的单菌落，判定为疑似无乳链球菌。将疑似菌接种于在50 mL/L绵羊血琼脂平板，可见灰白色、光滑、圆形、湿润、隆起的小菌落，直径0.5 mm～1 mm，形成溶血环，部分菌落无溶血环(图1)。革兰氏阳性，呈单个、成双、链状排列(图2)。

图1分离菌在血平板上的菌落形态

2.2 生化鉴定及触酶试验

分离菌可分解乳糖、蕈糖，不分解山梨醇、马尿酸钠及七叶苷，触酶试验均为阴性。结果与无乳链球菌的生化特性相符。

2.3 CAMP试验

CAMP试验中，无乳链球菌与金黄色葡萄球菌靠近的区域可见箭头状溶血增强区，12株无乳链球菌分离株的CAMP试验均为阳性(图3)。

2.4 PCR鉴定

特异性基因cfb和16SrRNA基因的PCR产物电泳结果显示，在681 bp和1466 bp左右可见特异条带，与预期目的片段大小一致(图4、图5)。16S rRNA测序结果经Blast比对分析，分离菌与GenBank中登录的无乳链球菌序列同源性均超过99%，证实12株分离菌为无乳链球菌。

图2分离菌株革兰氏染色镜检结果(1000×)

图3分离菌株的CAMP试验结果

M.DNA标准DL 2 000；1～12.分离菌株M.DNA Marker DL 2 000；1-12.Isolated strains

2.5 药敏试验

药敏结果显示，12株无乳链球菌对抗生素药物的敏感性有差异，对万古霉素、阿莫西林-克拉维酸、头孢哌酮和红霉素敏感，对卡那霉素、链霉素、环丙沙星和氨苄西林中度敏感，青霉素和四环素耐药(表2)。

M.DNA标准DL 2 000；1～12.分离菌株；13.阴性对照

3 讨论

无乳链球菌专性寄生乳腺组织，具有高度传染性，在我国各地区的乳房炎乳样中均被分离出[7-8]，对其研究有着重要的意义。本文调查新疆阿拉尔某奶牛养殖场的无乳链球菌的感染情况，结果表明，无乳链球菌的分离率为19.35%。低于刘凯等相关学者在多个地区的分离率[3]，同样也低于王蒴等在新疆地区的无乳链球菌感染率[7]。说明不同地区不同养殖场的分离率有较大差异。

病原菌分离鉴定工作对于奶牛养殖场病原菌的净化以及快速制定合理有效的防控策略至关重要。病原菌培养分离和生化鉴定仍被认为是金标准，但生化反应项目较多，耗时耗力，且有些菌株生化反应不典型，有一定的局限性。随着现代分子生物学技术的发展，PCR鉴定技术具有准确性、快速性和灵敏度高、数据分析和解释简单等优点，被广泛应用于病原菌的快速检测[10-12]。目前PCR鉴定技术主要基于16S rRNA基因和细菌特异性基因，cfb基因可以编码无乳链球菌毒力蛋白CAMP因子，有研究证实cfb基因比16S rRNA基因分辨力更高，更适用于无乳链球菌的鉴定[13]。本研究将传统的细菌鉴定方法与现代分子技术相结合，共分离鉴定12株无乳链球菌。

表2无乳链球菌分离株药敏性试验结果

目前，控制无乳链球菌感染主要采取提高饲养管理水平和抗生素应用，但由于抗生素的滥用，造成了无乳链球菌耐药菌株不断产生，在我国很多地区均有报道[14-17]。本研究中无乳链球菌对青霉素耐药率为58.30%，耐药性差异可能与我国多数奶牛场在治疗乳房炎时多次长时间应用青霉素有关。此外，分离菌株对四环素的耐药率达50.00%，可能由于牛场长期应用四环素治疗一些感染性疾病有很大的关系。本研究结果中，无乳链球菌对阿莫西林-克拉维酸钾、头孢哌酮、红霉素敏感性较好，建议该牛场选择以上3种药物进行交替用药。但随着我国一系列兽用抗生素规范性文件的出台，抗生素滥用问题不容小觑，中国特色的中草药、微生态制剂或疫苗将成为治疗奶牛乳房炎的发展趋势。