环状RNA在前列腺癌中的作用及研究进展

郭姗琦，姜行康

(1.天津中医药大学第一附属医院肿瘤科，国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381；2.天津医科大学第二医院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211)

据世界卫生组织国际癌症研究机构最新统计，前列腺癌(prostate cancer, PCa)是全球男性第2大常见肿瘤和第5大肿瘤死亡原因[1]。近年来，随着经济发展、生活方式的改变、人均寿命的延长以及医疗卫生水平的改善，我国PCa的发病率也呈显著上升趋势，流行病学调查显示，2020年PCa位居我国男性恶性肿瘤发病率第6位和死亡率第7位[2]。尽管诊断技术和治疗方案日益完善，部分患者在接受雄激素剥夺治疗后取得了较好的预后和生存率，但PCa的复发、转移和去势抵抗仍给患者带来了巨大的压力。与此同时，在提高PCa患者生存的同时也对临床医生提出了相当大的挑战，如何找到不同治疗方式的最适人群、如何建立疗效评估的生物标志物库、如何优化患者生存及改善预后等至关重要[3]。

环状RNA(circular RNA, circRNA)是一类普遍存在于细胞胞浆中的内源性非编码RNA，也是继微小RNA以及长链非编码RNA后非编码RNA家族中极具研究潜力的新成员[4]。与microRNAs和长链非编码RNA不同的是，circRNA不具备5’端帽子结构以及3’端poly A尾，依靠共价键形成单链环状结构，具有更高的稳定性，不易被RNA核酸外切酶或核糖核酸酶(RNase R)降解。其主要功能包括吸附miRNAs从而发挥调控靶基因的作用，调节基因的RNA结合蛋白从而影响与之相互作用的mRNA等[5](图1)。此外，细胞质中多个circRNA与特定蛋白的协同结合可对细胞外刺激做出快速反应，如在感染时迅速启动免疫反应等。随着高通量RNA测序技术和生物信息学的发展，越来越多的证据表明circRNA与前列腺癌的发生、发展及预后等密切相关，且由于其高稳定性、组织特异性以及存在的普遍性，可能成为PCa极具前景的生物标志物和治疗靶点[6]。因此，本文系统地总结了circRNA在PCa中的表达情况、调控机制及在诊断、治疗中的作用，以期为进一步发现PCa新型靶标提供依据。

图1 circRNA在前列腺癌中的作用机制图

1 circRNA在调控PCa恶性潜能中的作用

circRNA参与PCa的多种过程，包括细胞增殖、凋亡、侵袭迁移及转移等多种生物学过程。PI3K/Akt/mTOR信号通路在PCa癌前病变。肿瘤进展中发挥重要作用，靶向此信号通路的药物也显示出非常好的前景。研究发现circMBOAT2通过miR-1271-5p上调mTOR的表达，进一步激活PI3K/Akt信号通路，从而促进PCa细胞的增殖和转移[7]。还有研究表明来源于癌基因泛素特异性肽酶22(USP22)的circ102004可通过上调p-ERK、p-AKT、p-JNK、JNK和β-catenin的水平来促进体内、外PCa细胞的增殖，且与肿瘤侵袭性相关[8]。另一项研究表明，circ-ZNF609可通过上调miR-186-5p促进PCa细胞的增殖和转移，并增加磷酸化AMPK的比率，从而通过激活AMPK信号通路促进PCa进展[9]。此外，FOXO家族的FOXP4在体外可促进PCa进展，机制研究显示miR-1182或源自ABCC4基因的circABCC4可与FOXP4协同促进前列腺癌进展[10]。circ 0016068可以通过调节miR-330-3p的表达并介导其下游BMI-1来促进PCa细胞增殖和侵袭[11]。circGNG4可通过miR-223的海绵作用增强EYA3/c-Myc的表达，通过circGNG4/miR-223/EYA3/c-Myc途径促进前列腺癌恶性进展[12]。circ0005276还可与致癌基因FUS结合，上调circ0005276的宿主基因XIAP从而使PCa进展[13]。CDK13在PCa细胞中的过表达可促进细胞增殖，内源性CDK13的转录激活可诱导circCDK13、miR-212-5p/miR-449a和E2F5之间正反馈回路的形成，从而促进PCa的发生与进展，该调控轴也可能为治疗PCa进展的重要靶点[14]。在调节细胞周期方面，circHIPK3可通过修饰细胞分裂周期蛋白25促进PCa细胞G2/M期的转换，使G2/M细胞周期停滞[15]。circ-CSNK1G3可通过miR-181调节与细胞周期相关的基因，如CBX7、CDK1和CDC25A[16]。此外，DENG等[17]研究还发现circRNA-ARC1可能会影响miR-125b-2-3p和/或miR-4736，从而影响与转移相关的PPARγ/MMP-9信号而改变PCa细胞的侵袭。circ-FMN2在PCa患者组织中上调，可阻断miR-1238的海绵吸附作用，从而增强LHX2表达并促进PCa细胞增殖和转移[18]。上述研究表明circRNA对PCa的调控常常是基于“circRNA-microRNA-mRNA”这一模式，且其在PCa中的调控作用具有多通路、广靶点及网状调控的特点。

除促进PCa细胞恶性进展外，circRNA也可抑制其进展。ZHANG等[19]发现PI3K/Akt通路的负调控因子PTEN在PCa组织中低表达，而hsa_circ_0007494则可通过上调PTEN的表达抑制PCa细胞的增殖。一项研究发现circ_ITCH可以抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活，从而抑制PCa细胞的增殖和进展，观察到circ_ITCH在各种癌症中具有相似的功能[20]。Smad4是TGF-β信号通路的主要调控因子，Smad4可抑制雄激素受体(androgen receptor, AR)的反式激活并在PCa中低表达。来源于CRKL基因的circ_0001206可通过调节Smad4而抑制PCa进展，而这种抑制作用可被miR-1285-5p 逆转[21]。P53和RNA结合蛋白25(RBM25；p53的转录目标)可促进circ_000350(circAMOTL1L，来源于AMOTL1基因)在PCa中的表达，从而通过抑制细胞迁移并抑制波形蛋白和β-连环蛋白的表达最终抑制PCa进展[22]。体内、外实验证实过表达的circ itchy E3泛素蛋白连接酶可通过吸附miR-17-5p 来挽救Hox-B13的同源蛋白HOXB13(致癌基因)的降解[23]。

2 circRNA在PCa诊断中的作用

研究发现circAR3在PCa组织中高度表达，与前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)有多种相似之处，如两者都来自于前列腺组织或PCa组织，可以分泌到血浆中，其中circAR3在高Gleason评分或淋巴转移患者中表达更高[24]，故circAR3有望成为诊断、预后和评价PCa治疗效果的分子生物标志物。此外，考虑到AR-V7作为线性分子具有易降解和不稳定性的缺点，而circARs的变化趋势与去势抵抗性PCa组织中AR-Vs的变化趋势一致，因此，与血浆AR-V7分析相比，circARs以其较高的稳定性有可能更好地预测AR治疗的反应[25]。最新研究发现尿液细胞外囊泡circRNA可用于检测高级别PCa，这在PCa患者标志物方面是突破性的进展。HE等[26]使用RNA测序从11例高级别PCa患者和11例病例匹配的良性前列腺增生患者的尿液细胞外囊泡中识别2 231个差异表达的候选circRNA，其中18个上调的circRNA具有促癌作用的同时可能与PCa分级相关。进一步通过高级别PCa和对照组(前列腺良性增生及低级别PCa)的患者尿液验证，发现在PSA为2.0～10.0 ng/mL的患者中cirRNA可识别高级别PCa，且无需进行直肠指诊，也不需要特殊处理，仅收集患者尿液即可，具有可重复、无创、简单易操作等优点，可见circRNA在PCa标志物当中具有极大潜力。我们常常通过受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线下面积(area under curve，AUC)来判定circRNA的诊断价值，XIA等[27]研究了circ_0062019和circ_0057558的AUC分别为0.828和0.729，敏感性为80.0%和74.1%，特异性为74.6%和63.4%，有趣的是，当2种差异circRNA联合诊断时，AUC(0.861)优于我们熟知且认可的PSA检测(0.854)，表明多种circRNA的结合可能有更高的诊断价值。

3 circRNA在PCa治疗中的作用

近年来，circRNA作为潜在治疗靶点的研究在肿瘤学领域引起了广泛的关注，截止目前，提出2种靶向circRNA治疗肿瘤的策略：一是恢复具有肿瘤抑制活性的circRNA的功能，二是阻断具有致癌功能的circRNA。

雄激素剥夺是PCa的重要疗法，研究发现雄激素以浓度依赖的方式促进PCa细胞中circZMIZ1的表达，且AR与circZMIZ1的表达相互依存，二者之间可能存在正反馈调节关系[28]。同样，双氢睾酮处理后，circSMARCA5显著高表达，而抑制AR后其表达下降40%左右，表明circSMARCA5表达与AR信号有关，可能是雄激素依赖性的[29]。新型AR抑制剂恩扎卢胺(Enzalutamide，ENZ)可以延长去势抵抗性PCa患者的生存。然而，大多数患者最终会出现恩扎卢胺耐药，严重影响中晚期PCa患者的生存。circRNA可充当PCa中miRNA的储存库，circRNA17(circ_0001427)可增强miR-181c-5p而抑制AR剪接变体7(ARv7)的表达从而抑制PCa进展，且ARv7的与恩扎卢胺的耐药相关，故circRNA17可能是调控恩扎卢胺耐药的重要靶点[30]。还有研究显示Hsa_circ_0004870在ENZ抵抗细胞中下调，并可通过RBM39介导ENZ抵抗[31]。

关于circRNA在PCa化疗药物方面的研究目前尚少。研究显示，circFOXO3可抑制PCa细胞增殖、迁移、侵袭，并通过 circRNA/FOXO3/EMT途径影响多西他赛耐药[32]。SHEN等[33]研究发现circFOXO3在高级别PCa组织中显著降低，沉默circFOXO3能够显著促进细胞增殖、上皮-间质转化和多西他赛耐药，分子机制研究发现circFOXO3能够通过竞争性结合miRNA促进亲本基因FOXO3的水平从而抑制PCa的进展。GAO等[34]证实hsa_circ_0000735能够通过特异性结合miR-7促进PCa多西他赛耐药。尽管如此，关于多西他赛耐药性PCa circRNA的差异谱仍不清楚。另外，寻找和鉴定在多西他赛耐药细胞中特异性升高的circRNA，对后续临床预测标志物和治疗靶标的筛选具有重要意义。

放疗在PCa转移方面取得了令人兴奋的突破。然而，大部分PCa患者接受放疗后复发，这可能是由于PCa细胞对于放疗耐受性增强所致。研究表明circRNA参与PCa放疗敏感性的调控。circ-ZNF609在PCa组织和细胞中异常上调，且ZNF609可通过miR-501-3P/HK2轴加速肿瘤细胞糖酵解，促进PCa细胞的进展和放疗耐药[35]。CAI等[36]发现circ_CCNB2在耐辐射的PCa组织和细胞中过表达，抑制circ_CCNB2的表达可以通过miR-30b-5P/KIF18A轴增加PCa的放射敏感性，因此，抑制circ_CCNB2可以提高复发性PCa患者的放射治疗效果。这也为放疗抵抗的治疗提供了新的策略。

4 circRNA在PCa预后中的作用

Gleason评分、病理分期、淋巴转移、远处转移与PCa预后密切相关，包括生化复发率(biochemical recurrence，BCR)、无病生存期(disease-free survival，DFS)、总生存期(overall survival，OS)等是评估PCa预后的重要指标。研究发现PCa组织中circMTO1的高表达与T分期、N分期降低有关，且circMTO1高表达患者的DFS和OS均优于circMTO1低表达患者，多因素分析显示circMTO1的高表达可独立预测良好的DFS和OS[37]。HUANG等[38]通过对324例PCa根治性前列腺切除术患者采集癌及癌旁组织标本进行circITCH表达检测，结果显示PCa患者circITCH低表达与T分期进展和淋巴结转移高风险相关，且circITCH高表达患者的DFS和OS更好。此外，circRNA_LARP4的低表达和circABCC4高表达的PCa患者的5年生存率较差，而circMBOAT2的过表达则与DFS缩短有关[10，39-40]。生化复发是PCa进展的重要转折点，那么及早预测生化复发和及时的临床干预对于PCa患者的预后具有重要意义。ZHONG 等[41]发现与自噬相关的circRNA可作为生化复发PCa患者的预后因子。该研究经过筛选将5个与自噬相关的circRNA纳入预后模型，进一步结合风险评分和临床病理参数的nomogram预测PCa患者3年和5年的生化复发率，最后发现下调hsa_circ_0001747可能通过增强自噬而促进PCa，表明自噬相关的circRNA可能是预测PCa患者生化复发的重要指标。此外，ROCHOW等[42]通过全基因组circRNA微阵列分析6个PCa样本，鉴定出8个差异表达的circRNA(circATXN10、circCRIM1、circCSNK1G3、circucy1a2、circLPP、circNEAT1、circRHOBTB3和circSTIL)，并通过115个PCa癌组织和79个癌旁正常组织样本进行circRNA和线性RNA的验证，结果显示circATXN10联合linSTIL对恶性和相邻正常组织PCa具有较高的鉴别能力。linGUCY1A2、linNEAT1和linSTIL组合被证明是BCR的最佳预测RNA标记。这提示我们通过环状和线性RNA的模型综合评估PCa生化复发的预后具有临床潜力。

5 总结与展望

作为非编码RNA家族的重要一员，circRNA具有表达普遍、高度稳定、进化保守和组织特异性等特点，且在PCa增殖、转移和治疗耐药中发挥着关键作用。然而，由于RNA-seq技术和生物信息分析的局限性、肿瘤组织和外周血中circRNA表达量的不一致、以及RNA样本的纯度及细胞群混合的影响等诸多问题，也限制了circRNA的进一步临床诊疗转型。因此，我们可能需要更先进的检测技术和更大的患者队列来进行更深入的研究，也更有助于回答诸多问题，如定量检测在体液表达丰度低的circRNA的方式，靶向circRNA上游调控因子，从而从根本上阻断或促进其生物学功能的可能性等。虽然仍然面临着挑战，但我们从对circRNA更深入的研究中获得的结果将最终转化为临床实践，使广大PCa患者获益。