竹茹经Gas6/Axl通路对食管癌ECA109、TE1细胞的影响研究

康树宏 吕峰 韩继明

竹茹具有涤痰开郁、清热止呕的功效，在多种方剂中可见。现代药理证实，竹茹中含有多种有效成分，如丁香醛、苜蓿素等，进而发挥药效，起到治疗疾病的目的[1]。食管癌属于常见消化道恶性肿瘤，多数患者术后可以获得良好预后，但是仍有少数患者会出现肿瘤复发或转移情况[2]。有报道指出，Gas6/Ax1信号通路在食管癌进展中起关键性作用，认为调控Gas6/Axl通路可对食管癌细胞迁移、侵袭产生抑制[3]。目前临床关于竹茹抗癌治疗的研究笔者所见并不多，仅有少量学者认为竹茹不仅具有抑菌作用，对癌细胞增殖同样可以起到抑制作用[4]。本研究通过制取竹茹提取液对食管癌细胞进行干预，分析竹茹对食管癌细胞迁移、侵袭能力及Gas6/Axl通路相关蛋白的影响，进一步证实竹茹是否存在抗癌价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 组织样本:选取第四军医大学2019年1月至2020年12月接受食管癌切除手术患者术后组织样本，分别获取20例患者食管癌组织及癌旁组织。

1.1.2 细胞株:人源鳞状食管癌细胞株ECA109和TE1，由武汉尚恩生物技术有限公司提供。

1.1.3 药物制备:竹茹购于北京同仁堂有限公司，并经专家鉴定。首先对竹茹进行称重，粉碎后加入适量水浸泡，煎煮成药液，过滤后悬蒸，待药液粘稠后进行冷冻处理，制成竹茹冻干粉，之后制备100 μg/ml、200 μg/ml含竹茹培养基，4℃保存备用。

1.1.4 实验试剂:PBS缓冲剂、蛋白酶抑制剂(BI，以色列)，羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、Ax1抗兔一抗(Rockland，美国)，Gas6一抗(Sigma，美国)，胰蛋白酶、培养基(Gibco，美国)，PVDF膜(Millipore，美国)，胎牛血清(BI，以色列)等。

1.1.5 实验仪器:显微镜(尼康，日本)，匀浆机(新芝公司)，水浴箱(上海赫田科学仪器有限公司)，电化学发光仪(罗氏，瑞士)，生化检测分析仪(日立，日本)，离心机(华东公司)，电泳仪(Bio-Rad，美国)，数字天平、切片机等。

1.2 方法

1.2.1 HE染色:取未经放化疗干预的食管癌组织及癌旁组织，其中癌旁组织作为对照组，食管癌组织根据干预药物浓度不同分为竹茹低剂量组(100 μg/ml)、竹茹高剂量组(200 μg/ml)，经脱蜡、水化处理，苏木素染色2 min，冲洗载玻片，直至无染色剂脱落，进行5 min此同时盐酸酒精分化，冲洗后加热处理，采用伊红复染，冲洗，经梯度脱水后封片，显微镜下对组织染色情况进行观察。

1.2.2 组织样本Gas6免疫组化分析:取组织样本，经脱水、透明处理后进行石蜡包埋，切成4 μm厚度组织切片，65℃烤箱烘烤50 min，经脱蜡、水化处理，PBS漂洗，滴加抗原修复液，加热变性，PBS冲洗，滴加去离子水进行避光反应，10 min后冲洗，滴加抗体，滴加PBS作为阴性对照，孵育2 h，37℃，PBS冲洗，滴加二抗，室温，30 min，滴加DAB进行显色，染色采用苏木素，蒸馏水冲洗后封片，显微镜观察组织染色情况，将染为棕褐色细胞判定为阳性。

1.2.3 组织样本Ax1免疫荧光实验:取食管癌及癌旁组织样本，制成石蜡切片，加入抗原修复液，冲洗后甩干，滴加荧光淬灭剂，反应结束后冲洗，滴加BSA孵育30 min，依次添加一抗、二抗，反应结束后加DAPI进行细胞核复染，10 min，注意避光，冲洗后封片，镜下观察。在紫外的激发下，细胞染色后显示蓝色，荧光素标记显示红光即为NMDAR2B阳性。采用相关软件判定染色结果，获得样本阳性累积光密度值(IOD)。

1.2.4 细胞培养:取人鳞状食管癌细胞株ECA109和TE1，将细胞株置于水浴箱中进行解冻，轻轻晃动冻存管，促进细胞溶解。观察细胞解冻情况，待完全解冻后加培养基进行离心处理，分离获得沉淀，加新的培养基，过夜培养，观察细胞生长情况，取贴壁后对数期细胞进行传代。细胞传代最好控制在50代以内，可加入冻存液进行细胞冻存，用于后续研究。

1.2.5 配置竹茹培养基:取竹茹冻干粉，加入灭菌后培养基，根据需求分别配置成为200 μg/ml、100 μg/ml浓度的竹茹培养基，随配随用。

1.2.6 免疫双标实验检测Gas6、Ax1:取融合度达到90%的ECA109、TE1细胞，接种于24孔培养基，加入胰酶消化，每孔设置密度为5×104，二氧化碳浓度5%，37℃过夜，镜下观察细胞贴壁情况，分别采用不同浓度竹茹培养基进行干预，24 h后冲洗，经透膜干预后，再次PBS冲洗，每孔加入稀释后的一抗，4℃环境下过夜，弃上清后滴加荧光标记的二抗，避光孵育1 h，磷酸盐缓冲液冲洗，滴加含DAPI的封片油进行封片，镜下观察荧光情况。

1.2.7 EMT标志蛋白Snail、N-cadherin(N-ca)、E-cadherin(E-ca)蛋白免疫荧光观察:取融合度达到90%的ECA109、TE1细胞，接种于24孔培养基，固定采用多聚甲醛进行，结束后PBS冲洗，同样进行透膜处理，冲洗后滴加封闭液，滴加稀释后的一抗，1 h避光孵育，滴加经荧光标记的二抗，1 h 避光孵育，冲洗后封片，显微镜下对细胞荧光反应强度进行观察。

1.2.8 Westren blotting检测Ax1、Gas6蛋白表达水平:取食管癌细胞，将其接种于培养瓶中进行培养，观察细胞贴壁后进行竹茹干预，分别采用100 μg/ml、200 μg/ml含竹茹培养基进行干预，24 h后刮取细胞，离心处理分离沉淀，滴加常规培养基进行重悬。采用蛋白提取试剂盒进行总蛋白提取，通过BCA法对提取的蛋白浓度及纯度进行检测，绘制标准曲线，读取562 nm 波长处的OD值，根据所得数据计算上样DNA蛋白浓度。根据检测结果进行蛋白浓度调节，加热台上加热至变性，进行凝胶电泳处理，配胶，上样待测样本，在电泳槽中倒入电泳液，高度达到电泳槽2/3处，将电泳仪调节至恒压模式，结束后进行转膜，将PVDF膜取出，确定目的蛋白所在区域，并进行剪裁，保留目的蛋白位置，将其置于转模液中进行转模，结束后置于封闭液进行封闭，1 h后TPBS洗膜，滴加提前稀释好的一抗，反应结束后TBPS洗膜后加入显影液进行显影，浸润1 min，以β-ACT作为内参，采用JP-K900化学发光成像分析仪对显影情况进行分析，记录所得图像。

1.2.9 划痕实验:取食管癌细胞接种于96孔板，调整细胞密度，培养至细胞贴壁后进行实验。划痕器划痕，培养基清洗，加入不同浓度竹茹刺激细胞，镜下观察细胞迁移情况，记录时间分别为0 h、12 h。

1.2.10 Transwell侵袭实验:取培养基和融化后的Matrigel胶进行充分混合，并且将混合后的液体作为上室液，37℃培养3 h，待聚合呈凝胶后进行后续实验，上室加无血清培养基，下室加含20%胎牛血清培养基，在实验前各组细胞均饥饿培养12 h，每个上室中加重悬后细胞进行孵育，分别采用不同浓度竹茹干预，孵育结束后，多聚甲醛固定各小室细胞，擦去上室内细胞及基质胶，将下室面完全浸没在结晶紫溶液中染色，使用PBS缓冲液冲洗残留染色液，自然晾干后随机选取视野进行观察，时间选择0、24 h，视野数量选择5个，对染色情况进行高倍镜下观察，根据细胞转移情况判断细胞侵袭能力。

2 结果

2.1 食管癌、癌旁组织Gas6、Ax1表达情况 癌旁组织无浸润食管癌组织Gas6、Ax1高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1。

表1 食管癌、癌旁组织Gas6、Ax1表达情况比较

图1 食管癌、癌旁组织Gas6、Ax1表达情况(NC为癌旁组织，ESCC为食管癌组织)；A 免疫荧光检测Ax1表达；B 免疫组化检测Gas6表达

2.2 竹茹对Gas6/Ax1信号通路及复合体的影响 对照组食管癌ECA109、TE1细胞膜上Gas6、Ax1以及Gas6/Ax1复合体均呈现高表达状态，而竹茹干预组Gas6、Ax1表达降低，Gas6/Ax1复合体分离，竹茹高剂量组差异更加明显。见图2。

图2 竹茹对Gas6/Ax1信号通路及复合体的影响

2.3 竹茹对Gas6、Ax1蛋白表达的影响 在ECA109细胞中竹茹高剂量组、低剂量组Gas6、Ax1蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)，TE1细胞中竹茹高剂量组、低剂量组Gas6蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)，竹茹高剂量组Ax1蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)。见表2，图3。

表2 ECA109及TE1细胞中Gas6、Ax1蛋白相对表达水平

图3 ECA109及TE1细胞中Gas6、Ax1蛋白条带表达

2.4 竹茹对EMT标志性蛋白的影响 在ECA109细胞中竹茹高剂量组、低剂量组N-ca、Snail蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)，竹茹高剂量组E-ca蛋白表达高于对照组(P<0.05)；在TE1细胞中竹茹高剂量组、低剂量组Snail蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)，竹茹高剂量组N-ca蛋白低于对照组(P<0.05)，E-ca蛋白高于对照组(P<0.05)。见图4，表3。

图4 ECA109及TE1细胞中EMT标志性蛋白条带表达

表3 ECA109及TE1细胞中E-ca、N-ca、Snail蛋白相对表达水平

3 讨论

食管癌是目前世界上比较高发的消化道恶性肿瘤，因食管癌发病初期比较隐匿，导致多数患者发现时已进展至中晚期，降低治疗效果[5]。中医学中食管癌属于“噎膈病”范畴，通过查阅大量医学文献我们总结出“胃脘干耗”是导致食管癌发病的核心，因此在食管癌治疗中“甘润濡养”是关键[6]。已有研究证实，竹茹可有效改善恶心呕吐、便秘、吞咽困难等症状，并且可缓解患者放化疗治疗期间所产生的毒副作用[7]。也有报道指出，竹茹对食管癌复发、转移抑制作用[8]。因此本研究选取食管癌细胞进行竹茹干预，分析其对食管癌细胞相关蛋白以及侵袭、迁移能力的影响。

有报道指出，Gas6/Axl信号通路在食管癌的转移、侵袭过程中起到关键性作用[9]。也有学者选取食管癌组织样本进行免疫组化分析，结果证实Gas6、Ax1在肺癌组织中呈现高表达状态[10]。Gas6/Axl通路可能参与食管癌的进展和生存预后，并且在研究中指出Gas6可作为识别高危食管癌的标志物[11]。也要学者认为，癌细胞运动能力及侵袭能力会因Ax1高表达而增强[12]。本研究对食管癌患者食管癌组织及癌旁组织Gas6、Axl蛋白表达情况进行分析，进一步证实Gas6/Axl通路参与食管癌的发病。本研究结果显示竹茹可有效抑制Axl、Gas6蛋白表达，进一步分析可发现竹茹可对Gas6、Ax1以及Gas6/Ax1复合体表达产生抑制作用。提示竹茹可有效抑制Gas6、Ax1表达，阻止其发生进一步绑定和结合。

恶性肿瘤之所以会发生复发或转移主要是因为癌细胞通过血液、体液等方式迁移、侵袭至其他器官、组织，并进行定植[13]。因此降低肿瘤细胞迁移、侵袭能力对于改善恶性肿瘤患者预后非常重要[14]。曾有学者在研究中指出，细胞侵袭、迁移能力与食管癌远期预后之间存在密切联系[15]。本研究结果显示，竹茹可有效抑制食管癌细胞侵袭、迁移能力，且存在一定的剂量依赖性。上皮细胞-间充质转化(EMT)是一种反应程序，可使细胞丧失极性，降低细胞间连接强度，致使细胞发生游走[16]。

E-ca的表达下调或缺失可使EMT程序激活，减弱细胞间粘附性，进而导致肿瘤细胞发生转移[17]。N-ca同样属于EMT反应程序的标志物，在食管癌细胞中呈现高表达状态，有报道指出，N-ca与食管癌细胞的侵袭、恶化存在密切联系[18]。Snail同样属于EMT程序调控因子，可对细胞迁移功能起到抑制作用[19]。曾有学者在研究中指出，竹茹可有效抑制裸鼠食管癌肺转移，并且在研究中提出，抑制EMT程序相关蛋白表达是竹茹抑制食管癌肺转移的关键途径[20]。本研究对EMT程序相关蛋白表达水平进行分析，得出竹茹干预可有效降低食管癌细胞N-ca、Snail蛋白表达，提高E-ca蛋白表达，提示竹茹可通过调节N-ca、Snail、E-ca蛋白表达的方式影响EMT程序进而起到干预细胞迁移、侵袭的作用。

综上所述，Gas6、Ax1在食管癌中呈现高表达，而竹茹干预可使食管癌细胞Gas6、Ax1表达降低，抑制其侵袭、迁移能力，并且可能是通过调控EMT相关蛋白表达方式实现的。