重复韧化对普通玉米淀粉消化、理化性质和结构特性的影响

王雨生, 尚梦珊, 陈海华,3

(青岛农业大学食品科学与工程学院1，青岛 266109) (青岛农业大学学报编辑部2，青岛 266109) (青岛农业大学巴瑟斯未来农业科技学院3，青岛 266109)

湿热处理(HMT)是一种安全、高效的淀粉物理改性方法[1]，韧化处理(ANN)是湿热处理方法之一，通常将样品置于过量的水中，处理温度介于淀粉的玻璃化转变温度和糊化温度之间[2]。韧化处理能够改变淀粉的物化性质而不引起淀粉糊化或者淀粉颗粒的破碎[3]。韧化处理时，淀粉颗粒形状基本不变[4]，但颗粒表面会出现一些孔洞，这是内源性淀粉酶的作用及直链淀粉、支链淀粉重新结合的结果[3]。人们已经研究了韧化处理对木薯淀粉[5]、山药淀粉[2]、大米淀粉[6]、高粱淀粉[7]、玉米淀粉[4, 8]和橡子淀粉[3]理化性质的影响，发现韧化处理一般不改变淀粉颗粒的结晶晶型，韧化处理后，淀粉主要发生的结构、性质变化为：淀粉颗粒的膨胀程度和峰值黏度降低[9]；糊化温度升高，糊化温度范围减小[4]；吸水、吸油能力增强[10]；相对结晶度升高[11]；结晶结构完美程度和均一性增加[3]；淀粉颗粒内的淀粉分子链重排，相互作用增强[12]。王雨生等[13]研究还发现，延长韧化时间能够进一步提高玉米淀粉的糊化温度，提高韧化温度可以进一步增强玉米淀粉结晶稳定性。这些研究主要是针对淀粉进行的单次韧化处理(SANN)。

目前越来越多的学者开始关注2次或者多次重复热处理对淀粉理化性质和分子结构的影响。Chung等[10]发现，与单次韧化处理相比，韧化后再湿热处理(ANN-HMT)、湿热后再韧化处理(HMT-ANN)均能有效提高淀粉的热稳定性，降低淀粉的回生值；Zeng等[6]发现，与普通大米淀粉相比，湿热结合韧化处理(ANN-HMT或HMT-ANN)能降低糯性大米淀粉的糊化焓，提高其糊化温度和抗性淀粉含量；Pinto等[14]指出，与单次韧化处理相比，HMT-ANN对淀粉糊化温度和糊化焓的影响更明显；Shang等[15]研究发现，与单次湿热处理相比，2次湿热处理对普通玉米淀粉理化性质的影响更显著；Huang等[16]发现，增加重复湿热处理的次数可以进一步改变甘薯淀粉的结构、理化及消化性质；Wang等[12]发现，韧化处理结合超高压处理(ANN-UHP或UHP-ANN)能显著改变山药淀粉和马铃薯淀粉的糊化性质，严重破坏小麦淀粉的有序结构；Klein等[17]则报道，与单次湿热处理相比，2次湿热处理能降低大米淀粉膨胀力和溶解度，提高大米淀粉糊化黏度和糊化温度。前人的这些研究主要集中于2次湿热处理对不同来源淀粉的性质影响，目前很少有研究关注重复韧化处理对普通玉米淀粉理化性质和消化性质的影响。

本研究以普通玉米淀粉为研究对象，对比分析重复韧化处理次数对其微观结构、结晶结构、糊化性质、凝胶硬度和消化率等性质的影响，研究结果对扩展改性淀粉的应用有一定实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普通玉米淀粉(直链淀粉质量分数27%)，猪胰α-淀粉酶(VI-B，EC3.2.1.1, 16 U/mg)，糖化酶(EC3.2.1.3，100 U/mg)。

1.2 仪器与设备

TA·XT plus质构仪，S-3400N扫描电子显微镜，BK-POL偏光显微镜，D8-ADVANCE X射线衍射仪，iS10-type红外光谱仪，4D-type快速黏度分析仪。

1.3 方法

1.3.1 重复韧化处理(RANN)

参照Chung等[18]的方法对普通玉米淀粉进行热处理。取适量的普通玉米淀粉与水混合，调节含水量至80%。在55 ℃的水浴条件下振荡处理24 h后，3 500 r/min离心15 min，真空抽滤以除去多余水分，所得沉淀在45 ℃烘箱中鼓风干燥至含水量为10%，研磨并过100目筛，得单次韧化处理样品(RANN-1)。将单次韧化处理样品再重复1次和2次，分别得2次韧化处理样品(RANN-2)和3次韧化处理样品(RANN-3)。

1.3.2 膨胀力测定

淀粉样品膨胀力的测定参照Li等[19]的方法进行，膨胀力定义为样品沉淀物的湿质量与淀粉样品初始质量之比。

1.3.3 体外消化特性分析

参照Englyst等[20]和Wang等[21]的方法分析淀粉的体外消化特性。准确称取淀粉样品100 mg(以干基计)于具塞试管中，加入5 mL pH 5.2磷酸缓冲液，加入2.5 mL酶液(猪胰α-淀粉酶290 U/mL和糖化酶15 U/mL)，所得反应液于37 ℃振荡水浴，分别在20 min和120 min时用移液枪取0.5 mL反应液至10 mL离心管中，加入4.5 mL体积分数为73%的乙醇溶液灭酶，混匀后3 500 r/min离心10 min，取1 mL上清液，采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS)测定样品的快速消化淀粉(RDS)、缓慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)含量[22]。

1.3.4 糊化特性分析

参照Wang等[23]的方法，用RVA快速黏度计分析淀粉的糊化特性，记录淀粉的糊化温度(PT)、峰值黏度(PV)、崩解值(BD)和回生值(SB)等糊化特性参数。糊化后的样品冷却至室温并置于4 ℃冰箱储藏过夜，用于凝胶硬度的测定。

1.3.5 凝胶硬度分析

参照Wang等[24]方法，将1.3.4节所得淀粉凝胶取出后于室温下放置30 min，用质构仪和P/0.5的圆柱形探头分析样品的凝胶硬度，测试速度为0.5 mm/s，触发力为5 g，凝胶硬度为穿透深度10 mm时的最大力。

1.3.6 扫描电子显微镜观察(SEM)

样品粉末喷金后，固定在有导电性的双面胶上，用扫描电子显微镜放大2 000倍观察淀粉颗粒的微观形貌。

1.3.7 偏光显微镜观察

参照王雨生等[13]的方法，用偏光显微镜分析淀粉颗粒的偏光十字现象，取1%的淀粉悬浊液于偏光显微镜下，放大400倍观察。

1.3.8 X射线衍射分析(XRD)

淀粉粉末放于X射线衍射仪玻璃样品架凹槽内，摊平压紧，采用单色Cu-Kα射线进行衍射扫描，扫描范围4～40°，扫描速率0.1(°)/s，管电压40 kV，管电流40 mA。参照Zhang等[25]方法计算淀粉的相对结晶度(RC)，即结晶区面积与总面积比值。

1.3.9 傅里叶红外光谱分析(FT-IR)

参考Wang等[26]的方法分析，淀粉与溴化钾按质量比1∶100混合均匀并压片，FT-IR扫描范围4 000～400 cm-1，每4 cm-1扫描64次。记录FT-IR红外图谱，并计算1 047 cm-1和1 022 cm-1两处吸收峰强度比(R1 047/1 022)。

1.3.10 数据统计与分析

所有实验均重复3次，采用统计分析软件SPSS17.0进行数据分析，采用ANOVA和Duncan’s多重比较法对所有数据进行方差分析和差异显著性分析(P<0.05)，采用Excel 2016软件制图。

2 结果与分析

2.1 重复韧化对淀粉膨胀力的影响

由表1可知，普通玉米淀粉的膨胀力为12.6 g/g，不同次数的韧化处理均显著降低了普通玉米淀粉的膨胀力，且韧化次数越多，膨胀力越低。与普通玉米淀粉相比，韧化处理后淀粉的膨胀力降低了1.7～2.7 g/g，与RANN-1相比，RANN-3的膨胀力降低约1.0 g/g。这与Zeng等[6]、Chung等[27]、Huang等[16]2次湿热处理豌豆淀粉、扁豆淀粉和蜡质大米淀粉时膨胀力的变化趋势一致。膨胀力的降低可能是由于重复韧化处理增强了淀粉分子链间的相互作用力，使可利用羟基数量减少，限制了水分向淀粉颗粒内部的渗透[3]；另一个可能的原因是重复韧化处理增加了淀粉结晶结构的完美程度[2, 7]。

2.2 重复韧化对淀粉体外消化率的影响

如表1所示，韧化处理能够改变普通玉米淀粉的消化率，重复不同次数的韧化处理均提高了RDS和SDS的含量，降低了RS的含量。2次韧化处理后，RDS和SDS比NCS的增加了2.2%和2.4%，而RS含量则降低了4.5%。这与Zeng等[6]、Chung等[10]报道的ANN-HMT处理对淀粉中RDS、SDS和RS含量的影响结果一致。RDS含量的增加、RS含量的降低可能是因为重复韧化处理使淀粉颗粒表面孔洞或裂缝增多，促进直链淀粉的渗漏，水解酶更容易进入淀粉颗粒内部[9]。SDS的增加则可能是由于韧化过程增强了淀粉分子链间的强相互作用，一定程度上限制了酶对淀粉分子链的作用[7]。淀粉的消化率通常受淀粉的来源、直支比和结晶结构的影响[7, 28，29]。Zeng等[6]研究表明单次韧化处理能够改变淀粉的消化率，一方面，韧化处理导致直链淀粉与直/支链淀粉间相互作用的增强，趋向于形成具有完美晶体结构的淀粉，降低淀粉的消化率，另一方面，韧化处理使淀粉颗粒表面孔洞变多，则会提高淀粉的消化率。随着韧化次数的增加，RDS和SDS的含量逐渐降低，RS的含量逐渐增加。这可能是因为多次韧化处理进一步增强了淀粉分子链间的强相互作用，进一步提高了结晶结构的完美程度。韧化温度低于淀粉的糊化温度，因此重复韧化处理过程中，淀粉颗粒不会发生糊化，但淀粉分子链会发生重排导致淀粉颗粒结构改变，如导致结晶度增加等[7]。尽管淀粉颗粒表面的孔洞、裂缝增多，但淀粉颗粒结构的改变使进入淀粉颗粒内部的水解酶不能进行有效水解[7, 27]，即淀粉分子链的相互作用、结晶完美程度对淀粉消化率起到更加重要的抑制影响，这与Zeng等[6]的观点一致。因此，增加重复韧化次数是改变淀粉RDS、SDS和RS含量的一种重要方式。

表1 不同次数韧化处理的普通玉米淀粉膨胀力和体外消化参数

2.3 重复韧化对淀粉凝胶硬度的影响

普通玉米淀粉凝胶硬度为266 g(图1)，经不同次数的韧化处理后，凝胶硬度显著增加了115～192 g，且随着韧化处理次数的增加，凝胶硬度从RANN-1的381 g逐渐增加至RANN-3的458 g。Shang等[15]发现，经过2次湿热处理，淀粉凝胶硬度增加。凝胶硬度的增加可能是因为热处理使淀粉链之间的相互作用增加，淀粉凝胶中形成了较强的连接区[15]；另外，重复韧化处理进一步提高淀粉颗粒结晶结构的完美程度[30]，也会增加淀粉凝胶硬度。凝胶的形成可能与直链淀粉线性链段的平行排列有关[8]，其硬度主要由淀粉结晶区膨胀颗粒的硬度决定[29]。韧化处理样品中，RANN-3的凝胶硬度最高，这也说明淀粉凝胶硬度与韧化处理次数有关。

注：柱状图上的不同小写字母表示数据间存在显著差异(P<0.05)。图1 RANN处理的普通玉米淀粉凝胶的硬度

2.4 扫描电镜和偏光显微镜图片

根据扫描电镜观察结果(图2a～图2d)，普通玉米淀粉由体积大而不规则的多角形颗粒和一些体积较小的球形颗粒组成，表面光滑，这与Liu等[7]的报道一致。重复韧化处理并没有改变普通玉米淀粉的颗粒状态，没有出现淀粉颗粒聚集状态，这与已有研究，即单次韧化处理不显著影响蜡质玉米淀粉、高直链玉米淀粉[4]、橡子淀粉[3]的形状等结果一致；Molavi等[3]也报道，橡子淀粉在ANN-HMT处理中没有出现淀粉聚集状态。这可能是因为韧化处理温度为55 ℃，低于普通玉米淀粉的糊化温度[1]，可以保护淀粉颗粒结构的完整性。

但重复韧化处理对普通玉米淀粉颗粒外貌有影响，与天然淀粉颗粒相比，重复韧化处理后，淀粉颗粒表面出现很多孔洞，且随着韧化处理次数的增加，越来越多的淀粉颗粒形成多孔表面。对比可以发现，RANN-1的淀粉颗粒表面孔洞少、小、浅，而RANN-2和RANN-3淀粉颗粒表面孔洞多、大、深。这说明韧化次数越多，对淀粉颗粒形貌的影响则越大。Huang等[16]发现，多次HMT处理能使甘薯淀粉颗粒形成多孔表面，Molavi等[3]也发现，ANN-HMT可以在橡子淀粉表面形成很多孔洞。淀粉颗粒表面孔洞的产生可能是因为重复韧化处理促进了小分子直链淀粉从淀粉颗粒中游离出来，从而留下较多的孔洞[3]；也可能是在内源酶的作用下，重复韧化处理加速了酶对淀粉颗粒表面的侵蚀[31，32]。

注：a，e NCS; b，f RANN-1;c，g RANN-2;d，h RANN-3。图2 重复韧化处理普通玉米淀粉的扫描电镜图(×2 000，a～d)和偏光显微镜图(×400，e～h)

在偏振光下，普通玉米淀粉呈现典型的偏光十字现象(图2e～图2h)，而重复韧化处理并没有改变淀粉颗粒的双折射特性，这与Chung等[27]、Vamadevan等[4]报道的单次韧化处理不改变豌豆淀粉、扁豆淀粉、蚕豆淀粉双折射特性的结果一致。这表明，重复韧化处理过程中，淀粉的颗粒结构和层状结构未被破坏，能产生双折射现象的结晶结构保存完好。

2.5 重复韧化普通玉米淀粉的X射线衍射图谱和相对结晶度

普通玉米淀粉在2θ为15.3°、17°、18°和23.5°附近有明显的衍射峰(图3)，为典型的A型结晶结构。19.8°处的衍射峰说明普通玉米淀粉颗粒具有V型结晶结构，这可能是由于普通玉米淀粉具有直链淀粉-脂肪酸复合物的有序结构[4]。与普通玉米淀粉相比，重复韧化处理均没有改变淀粉颗粒的结晶晶型。Wang等[12]发现，在ANN-UHP处理过程中，小麦淀粉、山药淀粉和马铃薯淀粉的X射线衍射图谱没有明显变化，Shang等[15]的研究结果也说明两次湿热处理没有改变普通玉米淀粉的结晶晶型。上述结果表明，重复韧化处理过程中淀粉的双螺旋结构并没有发生熔融，结晶晶型未被破坏。

普通玉米淀粉的相对结晶度RC为32.3%，重复韧化处理后，RC明显增加。与普通玉米淀粉相比，RANN-3的RC增加了4.1%。随着韧化处理次数的增加，RC逐渐升高，这可能是因为韧化处理[6]增加了淀粉结晶结构的完美程度，晶粒的取向性增强，原本未相互交联的淀粉分子在韧化条件下发生相互作用而形成新的结晶[6, 28]。这一结果表明韧化处理次数影响淀粉的RC。

图3 普通玉米淀粉重复韧化处理前后的XRD图谱

2.6 重复韧化普通玉米淀粉的红外光谱

图4为普通玉米淀粉FT-IR图谱淀粉骨架吸收峰信息：位于3 443 cm-1和2 928 cm-1附近的宽峰是—OH和—CH的拉伸振动[33]；位于1 644 cm-1和1 155 cm-1附近的吸收峰是H2O弯曲振动和C—O—C拉伸振动[34]；位于1 080 cm-1、1 023 cm-1和930 cm-1附近的吸收峰是C—O—H弯曲振动和—CH2的拉伸振动[16]。不同次数的韧化处理对普通玉米淀粉典型吸收峰没有明显的影响，这一结果与Zeng等[6]研究单次韧化处理对蜡质玉米淀粉的影响结果一致。

图4 普通玉米淀粉重复韧化处理前后的FT-IR图谱

位于1 047 cm-1和1 022 cm-1处的吸收峰反映淀粉中的有序结构和无定型结构，通常用两处的吸收峰强度比表示(R1 047/1 022)[16]。根据图4，随着韧化处理次数的增加，R1 047/1 022逐渐增加，比普通玉米淀粉增加了0.11～0.15。Zeng等[6]发现ANN-HMT提高了蜡质大米淀粉的R1 047/1 022，Huang等[16]报道重复HMT处理次数超过3次，甘薯淀粉的R1 047/1 022明显增加，Chung等[27]发现湿热处理不改变淀粉的FT-IR图谱，但对淀粉的R1 047/1 022产生明显的影响。这表明，重复韧化处理提供的热能和高湿度能促使淀粉结晶区形成更多的双螺旋结构[6]，促进淀粉颗粒表面形成更加完美的结晶结构。这与相对结晶度的结果一致。

2.7 重复韧化普通玉米淀粉的糊化性质

由表2可以看出，重复韧化处理对普通玉米淀粉的糊化特性有显著影响：糊化温度(PT)明显升高，峰值黏度(PV)、崩解值(BD)、回生值(SB)显著降低。PT是淀粉颗粒开始吸水膨胀并形成黏稠溶液的温度有关[15]。随着韧化处理次数的增加，与天然淀粉相比，PT增加了1.7～2.3 ℃，但是RANN-2和RANN-3之间的变化很小。糊化温度的提高说明RANN提高了淀粉结晶结构的完美程度，即破坏淀粉颗粒结构并形成淀粉糊所需的能量增加，因此糊化温度升高[35]，这与X射线衍射实验、红外光谱实验结果一致。其原因可能是重复韧化处理促进淀粉分子重排，提高了淀粉颗粒内部分子间的相互作用力[2]。

随着韧化处理次数的增加，与普通玉米淀粉相比，峰值黏度降低了217～361 mPa·s，但RANN-2和RANN-3的峰值黏度没有显著差别。这与之前报到的ANN-HMT处理能降低橡子淀粉PV的结果一致[3]。加热过程中，淀粉糊黏度的增加主要是由于淀粉颗粒的膨胀、渗漏直链淀粉相互作用、支链淀粉含量增加等[18]。PV降低可能是由于重复韧化处理使淀粉颗粒内部分子链重排，降低了淀粉颗粒的膨胀程度，束缚了直/支链淀粉的渗漏和溶解，从而使淀粉糊黏度下降[35]。另外，韧化处理有利于淀粉分子链形成稳定的构象，可能会进一步限制直链淀粉分子从淀粉颗粒中渗漏出来[5]。

表2 RANN处理前后普通玉米淀粉的糊化参数

与普通玉米淀粉相比，重复韧化处理后，淀粉的BD和SB明显降低，且随着重复韧化处理次数的增加，BD和SB均逐渐降低。这一结果与ANN-HMT处理能够降低玉米淀粉[18]和橡子淀粉[3]的BD、SB结果一致。韧化处理后，淀粉BD的降低说明重复韧化处理提高了淀粉糊对热和剪切的稳定性[14, 16]。这可能是因为重复韧化处理使淀粉分子链重新取向、排列，强化了直链淀粉与支链淀粉侧链间的相互作用[2, 14]，增加了淀粉糊化过程中淀粉颗粒的破碎难度。冷却过程中，渗漏直链淀粉分子可通过氢键重新排列，形成聚集体[29]，表现为淀粉糊液黏度升高，但重复韧化降低了普通玉米淀粉的SB，可能是由于重复韧化处理形成一些结构致密的颗粒，导致渗漏直链淀粉分子链的相互交联作用不充分[18, 35]。

因此，普通玉米淀粉经重复韧化处理后，PT值升高，即破坏淀粉的颗粒结构需要更高的温度；BD和SB值降低，淀粉颗粒的热稳定性升高，淀粉的老化减缓；增加重复韧化处理的次数，可进一步促进淀粉分子链间的重新缔合，提高淀粉糊的稳定性。

3 结论

研究重复韧化处理对普通玉米淀粉消化特性、理化特性和结构特性的影响。结果表明，重复韧化处理能够降低普通玉米淀粉抗性淀粉含量，减小淀粉膨胀力、糊化峰值黏度、衰减值和回生值，提高普通玉米淀粉缓慢消化淀粉含量，提高淀粉的糊化温度、相对结晶度及R1 047/1 022值。重复韧化处理在淀粉颗粒表面产生很多孔或洞，但并不改变淀粉颗粒的微观形貌、结晶晶型和结构。增加韧化处理次数，可以进一步提高普通玉米淀粉抗性淀粉含量、相对结晶度和糊化温度，降低衰减值和回生值等。重复韧化处理通过促进淀粉分子链的重新排列而达到优化普通玉米淀粉结构和性质的作用。