2种化学型的黄花蒿萜类代谢物及其相关基因表达分析

2022-09-21 03:02王婷婷戴仕林刘潺潺蒋征吴啟南
南京中医药大学学报 2022年9期
关键词:萜类樟脑代谢物

王婷婷,戴仕林,刘潺潺,蒋征,吴啟南,3

(1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;2.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,江苏 南京 210023;3.中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心,江苏 南京 210023)

形态特征无明显差异的同种植物由于所含代谢物组成或含量的差异可被区分为不同的化学型,化学型是植物种内变异之一,体现了种内生物多样性[1]。化学型一般是由遗传因素和环境因素共同作用形成的,并且在药用植物中普遍存在。不同产地或不同品种间药用植物所含代谢物存在一定差异,进而对其药效产生影响。因此,化学型形成机制的研究对药材道地性的阐明、药材质量控制具有重要的理论意义和应用价值。

菊科植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.为一年生草本,干燥的全草入药为青蒿药材,有浓郁香气,是提取抗疟特效药青蒿素的原料。黄花蒿含有丰富的挥发性成分,以单萜、倍半萜为主,现有研究表明其具有良好的抗菌[2-5]、抗氧化[6-8]、解热[5]等作用。黄花蒿作为一种高抗逆性物种,分布广泛[9],不同地区的黄花蒿挥发性成分的组成和含量均差异明显,药理活性也各有侧重。

江苏和河南均为青蒿药材的传统产区[10],并且江苏盱眙产青蒿药材是品牌中成药的原料药之一[11],两地药材挥发性成分研究对黄花蒿药用资源的利用具有重要意义。本研究通过顶空-气相色谱-三重四极杆串联质谱(HS-GC-QQQ-MS/MS)分析2个产地黄花蒿的挥发性成分,超快速高效液相色谱-三重四级杆飞行时间串联质谱(UFLC-Triple TOF-MS/MS)非靶向分析不同化学型差异代谢物,并采用转录组测序分析相关萜类成分基因表达,以期为黄花蒿化学型形成机制研究提供基础。

1 材料

1.1 仪器

HS-GC-QQQ-MS/MS(7697A-7000C)(美国Agilent公司);SIL-20A XR超快速液相色谱仪(日本Shimadzu公司);Triple TOFTM5600 System-MS/MS高分辨四极杆飞行时间质谱仪(美国AB Sciex公司);万分之一电子分析天平(日本Shimadzu公司);SAGA-TY纯水机(南京易普易达科技发展有限公司);冷冻离心机(美国Beckman coulter公司);冷冻干燥机(美国Labconco公司);-80 ℃低温保存冰箱(青岛海尔生物医疗股份有限公司)。

1.2 试药

江苏产黄花蒿种子由江苏盱眙青蒿药材基地提供(北纬33.0°,东经118.48°),样品编号:JXAa;河南产黄花蒿种子由实验室在河南中牟县收集(北纬34.44°,东经113.94°),样品编号:HZAa;家庭园艺营养土(美乐棵);甲醇(美国Merck公司);乙腈(美国Merck公司);乙酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 植物种植和取样

将两地黄花蒿种子撒于装土的方形盆(11 cm×11 cm×9.5 cm)中,在温度(25±2)℃,湿度60%~70%的条件下萌发,长至1个月后,将幼苗移栽至方形盆(10 cm×10 cm×14 cm),每盆1株,待生长近5个月时,经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为菊科蒿属植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.。JXAa和HZAa各选3株,取其叶片,低温冷藏,用于后续转录组测序分析和化学成分分析。

2.2 样品制备

2.2.1 HS-GC-QQQ-MS/MS样品制备 分别取JXAa、HZAa黄花蒿鲜叶各200 mg,置于规格为25 mL配有聚四氟乙烯胶垫的顶空瓶中,压盖密封。

2.2.2 UFLC-Triple TOF-MS/MS样品制备 分别取JXAa、HZAa黄花蒿鲜叶,冷冻干燥2 d,粉碎,过4号筛,称取100 mg粉末,溶于0.6 mL 70%甲醇提取液,置于4 ℃条件下的摇床上振摇过夜。10 000 r·min-1冷冻离心10 min,吸取上清,0.22 μm微孔滤膜过滤,置于进样瓶。

2.3 HS-GC-QQQ-MS/MS测定条件

2.3.1 顶空平衡条件 加热箱65 ℃;样品平衡40 min;进样持续时间0.5 min;GC循环52 min;在加热箱中震荡样品瓶(71 min-1)。

2.3.2 色谱条件 色谱柱:Agilent 19091S-433UI HP-5MS UItra Inert(30 mm×250 μm,0.25 μm);流速:1.0 mL·min-1;升温程序:初始温度50 ℃,保持2 min,以4 ℃·min-1的速率升温至110 ℃,以8 ℃·min-1的速率升温至130 ℃,以3 ℃·min-1的速率升温至180 ℃,以10 ℃·min-1的速率升温至240 ℃,保持5 min;进样口温度:250 ℃;进样量:1.0 μL;分流比:30∶1[11]。

2.3.3 质谱条件 离子源温度:230 ℃;电子轰击能量:70 eV;离子扫描范围:50~450 aum;MS1四极杆温度:150 ℃。

2.4 UFLC-Triple TOF-MS/MS测定条件

2.4.1 色谱条件 色谱柱:Agilent ZORBAX Elipse Plus C18Rapid Resolution HD(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)。流动相:A相为超纯水(加入0.04%乙酸),B相为乙睛(加入0.04%乙酸)。洗脱梯度:0~10.00 min,5%~95%B;10.00~11.00 min,95%B;11.00~12.00 min,95%~5%B;12.00~14.10 min,5%B。流速0.35 mL·min-1;柱温40 ℃;进样量4 μL。

2.4.2 质谱条件 在正、负离子模式下采集数据;质量扫描范围m/z:50~1 500;离子源温度(TEM):550 ℃;帘气(CUR)流速:40 L·min-1,雾化气(GS1)流速:60 L·min-1;辅助气(GS2)流速:60 L·min-1;喷雾电压(IS)正离子模式5 500 V,负离子模式-4 500 V;去簇电压(DP)正离子模式100 V,负离子模式-100 V。

2.5 转录组测序

分别取JXAa、HZAa样品各3份作为生物学重复,委托武汉华大医学检验所有限公司高通量实验室使用DNBSEQ平台进行测序。

2.6 数据处理

2.6.1 HS-GC-QQQ-MS/MS数据处理 使用Agilent MassHunter Qualitative analysis B.07.00软件进行分析,NIST14标准质谱图库鉴定化合物。

2.6.2 UFLC-Triple TOF-MS/MS数据处理 将原始数据通过Analysis Base File Converter转化为abf格式文件并导入MS-DIAL 4.24[12],设置一级质谱偏差为0.01 Da,二级质谱偏差为0.025 Da,最小峰高为1 000,进行峰提取和峰识别;保留时间偏差为0.05 min,进行峰对齐,最终获得由峰保留时间、峰质荷比、峰面积等构成的数据矩阵。将处理好的数据以CSV格式保存并导入MetaboAnalyst 5.0[13],在Statistical Analysis模块下进行峰面积归一化及对数转换,将数据进行t检验以及正交偏最小二乘分析(OPLS-DA),筛选差异数据。Functional Analysis模块下导入筛选后的差异数据,通过Plants项下Arabidopsisthaliana(KEGG)数据库进行代谢物鉴定。将鉴定好的差异代谢物导入Pathway analysis模块进行代谢物通路分析,选择散点图作为数据可视化方法,通路富集方法采用超几何分布检验,拓扑分析选择Relative-betweeness centrality,数据库为Arabidopsisthaliana(KEGG),并且选择数据库中所有化合物作为通路富集分析的参考。

2.6.3 转录组数据处理 在测序所得的原始数据(Raw reads)中过滤低质量、接头污染以及未知碱基(N)含量过高的数据,然后将过滤后数据(Clean reads)比对到参考基因组(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genbank/plant/Artemisia_annua/latest_assembly_versions/GCA_003112345.1_ASM311234v1/),检测不同样品之间的差异表达基因,结合GO、KEGG等数据库进行差异基因功能注释,随后对已注释的差异基因进行GO注释分析和KEGG代谢通路分析。使用TBtools软件[14],以转录组数据作为数据库,用黄花蒿基因组中冰片脱氢酶和黄花蒿醇脱氢酶2(ADH2)基因序列进行blast比对,寻找转录组数据中编码冰片脱氢酶和ADH2候选基因的表达数据。

3 结果

3.1 HS-GC-QQQ-MS/MS结果分析

2组样品共鉴定出22种化学成分,相同化合物12种,根据主成分相对含量占比,确定JXAa为蒿酮型、HZAa为樟脑型,见图1、表1。蒿酮型共鉴定出15种成分,其中萜类11种,相对含量最高的是蒿酮(51.28%),其次是桉叶油醇(12.37%)。樟脑型共鉴定出19种成分,其中萜类15种,相对含量最高的是樟脑(30.7%),其次是莰烯(21.38%)。2组样品除挥发性成分樟脑以外,相同化合物的相对含量,蒿酮型占比为44.91%,樟脑型占比为58.81%。

注:A.JXAa;B.HZAa

表1 黄花蒿挥发性成分(n=4)

3.2 UFLC-Triple TOF-MS/MS结果分析

2种化学型在正、负离子模式下UFLC-Triple TOF-MS/MS基峰图,见图2~3。2种化学型黄花蒿在PCA、OPLS-DA图中均分离明显,OPLS-DA模型验证发现正、负离子模式下Q2回归线与Y轴相交低于零,负离子模式下R2绿点基本上低于最右R2绿点,即原始点,说明模型稳定性较好,见图4~5。

注:A.正离子模式;B.负离子模式

注:A.正离子模式;B.负离子模式

图4 正离子模式下2种化学型黄花蒿PCA图(A)、OPLS-DA得分图(B)、OPLS-DA模型验证图(C)

VIP可以衡量代谢物对OPLS-DA模型的重要程度,通常作为筛选差异代谢物的指标之一。本实验以VIP≥1和P<0.05作为筛选差异代谢物标准。在正、负离子模式下共筛选出253个差异代谢物,其中蒿酮型上调的差异代谢物有182种,樟脑型上调的差异代谢物有71种。

在代谢通路图中,圆圈代表代谢通路,圆圈大小表示样品中所含该通路的代谢物对代谢通路的影响,圆圈颜色表示显著性(P值)大小,P值越大,圆圈颜色越红。蒿酮型黄花蒿排名靠前的萜类代谢通路中有挥发性成分相关的倍半萜、三萜生物合成,见图6A;樟脑型黄花蒿排名靠前的萜类代谢通路主要是二萜生物合成,见图6B,其中二萜生物合成代谢通路上调化合物主要是赤霉素合成通路上的物质ent-7α-Hydroxykaur-16-en-19-oic acid、Kaur-16-en-18-ol、Kaur-16-en-18-al、香叶基芳樟醇[(E,E)-Geranyllinalool]等,见表2。

表2 樟脑型黄花蒿二萜通路上调差异代谢物

图5 负离子模式下2种化学型黄花蒿PCA图(A)、OPLS-DA得分图(B)、OPLS-DA模型验证图(C)

图6 蒿酮型(A)和樟脑型(B)黄花蒿上调代谢物通路分析

3.3 转录组数据分析

实验样品比对基因组[15]的平均比对率为81.35%,共检测到表达的基因数为46 413。基于负二项分布原理,本实验根据Love等[16]描述的方法进行差异基因检测,共检测到10 023个差异基因,用火山图来表示差异基因的分布,见图7A,发现蒿酮型黄花蒿上调差异基因数为5 136,樟脑型黄花蒿上调差异基因数为4 887。

3.3.1 GO注释分析 GO共有三大功能类:生物过程(Biological process)、细胞组分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)。生物过程大类共21个亚类,其中占比最高的亚类是细胞过程(Cellular process),注释数量为3 650,其次是代谢过程(Metabolic process),注释数量为29 922。细胞组分大类共3个亚类,其中细胞结构实体(Cellular anatomical entity)和细胞内(Intracellular)占比最高,注释数量分别为5 659和3 100,其次是含蛋白质复合物(Protein-containing complex),注释数量为967。分子功能大类共16个亚类,其中占比最高的是2个亚类是催化活性(Catalytic activity)和结合(Binding),注释数量分别为4 562和4 452,见图7B。

图7 2种化学型黄花蒿差异基因火山图(A)和差异基因GO分类图(B)

3.3.2 萜类基因分析 根据HS-GC-QQQ-MS/MS数据,2种源黄花蒿的挥发性成分中单萜组分差异明显,据此分为2种化学型。UFLC-Triple TOF-MS/MS数据中可以发现挥发性成分相关的萜类差异代谢物主要集中于二萜代谢通路和倍半萜、三萜代谢通路。萜类化合物的碳骨架是通过代谢中间体异戊烯二磷酸和二甲烯基焦磷酸缩合而成,二者在自然界中通过甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径生成。在转录组数据中萜类骨架MEP途径和MVA途径共注释到11个关键酶[1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、4-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)、异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPI)、异戊烯基转移酶牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)、乙酰辅酶A酰基转移酶(AACT)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(MK)、甲羟戊酸激酶(PMK)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPDC)、法尼基焦磷酸合酶(FDPS)]的23个候选基因具有显著差异。异戊烯二磷酸和二甲烯基焦磷酸经由GPS、GGPS催化形成单萜、二萜。其中单萜合成路径中,1,8-桉树脑合酶(TPS-Cin)在桉叶油醇生物合成中起到重要作用,本次测序共检测到10个候选基因,其中9个在樟脑型中高表达。在樟脑合成路径中发现2个在樟脑型黄花蒿中高表达的冰片脱氢酶候选基因,并且在蒿酮拟合成路径[17]中发现3个蒿酮型黄花蒿中高表达的ADH2候选基因。赤霉素合成路径中共注释到6个关键酶[内根-古巴焦磷酸合成酶(CPS)、贝壳杉烯C19氧化酶(GA3)、赤霉素双加氧酶(GA20OX)、赤霉素3-β-双氧酶(GA3OX)、香叶基芳樟醇合酶(TPS04)、三甲基十三烷四烯合酶(CYP82G1)]的11个候选基因在樟脑型黄花蒿中高表达,见图8。

注:AK-T.蒿酮型;C-T.樟脑型;DXS.1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶;HDR.4-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶;IPPI.异戊烯基焦磷酸异构酶;GPS.异戊烯基转移酶牻牛儿基焦磷酸合酶;GGPS.牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶;AACT.乙酰辅酶A酰基转移酶;HMGR.3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶;MK.甲羟戊酸激酶;PMK.甲羟戊酸激酶;MPDC.甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶;FDPS.法尼基焦磷酸合酶;CPS.内根-古巴焦磷酸合成酶;GA3.贝壳杉烯C19氧化酶;GA20OX.赤霉素双加氧酶;GA3OX.赤霉素3-β-双氧酶;TPS04.香叶基芳樟醇合酶;CYP82G1.三甲基十三烷四烯合酶;ADH2.黄花蒿醇脱氢酶2;TPS-Cin.1,8-桉树脑合酶

4 讨论

同种药用植物以化学型分型,影响分型的代谢物差异明显,可能对其药效产生影响,从而影响药材品质。李洪梅等[18]在探究不同化学型樟挥发油对大鼠足跖关节炎症模型的影响实验中发现异樟挥发油对大鼠关节肿胀抑制率高于脑樟和龙脑樟挥发油,脑樟挥发油对细胞因子白介素-6(IL-6)的生成抑制明显高于龙脑樟和异樟挥发油,不同化学型樟挥发油缓解关节炎症的效果和作用机制均存在差异。Montero-Villegas等[19]发现Tagetenone型Lippiaalba挥发油可通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡的方式选择性地抑制人肝癌细胞和人肺腺癌细胞增殖,并且降低3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶活性和抑制胆固醇生成。Acimovic等[20]根据黄花蒿挥发油组分将其分为4种化学型:蒿酮+蒿醇型、蒿酮型、樟脑型、非特异性化学型。以樟脑(44%)、大牛儿烯D(16%)为主的黄花蒿挥发油对希拉肠球菌和2种真菌的生长均有显著抑制作用[21]。而以蒿酮(30.7%)、樟脑(15.8%)为主的黄花蒿挥发油具有良好的抗氧化能力,并对流感嗜血杆菌、粪链球菌、肺炎链球菌、克鲁斯氏念珠菌有较好的抑制作用[22]。因此,药用植物通过化学型分型并对其形成机制研究的深入对药材的品质评价具有重要的影响意义。

根据HS-GC-QQQ-MS/MS分析结果,来源于2个地区黄花蒿种子在同一环境下种植生长可分为2种化学型,JXAa为蒿酮型,HZAa为樟脑型。在单萜合成路径中发现2个冰片脱氢酶候选基因在樟脑型黄花蒿中显著高表达,而在蒿酮型黄花蒿中表达量极低,冰片脱氢酶候选基因的高表达可能是形成樟脑型黄花蒿的主要原因。蒿酮的生物合成路径尚未完全解析,目前已知其可能通过MEP和MVA萜类骨架生成2分子二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP),但并没有遵循经典的异戊二烯规则生成单萜前体牻牛儿基焦磷酸,而是生成菊酰基焦磷酸[23-25],其最后一步蒿醇推测是通过ADH2氧化生成蒿酮[26]。本次转录组数据中共发现3个在蒿酮型黄花蒿中高表达的ADH2候选基因,这可能促进蒿酮型黄花蒿中蒿酮的积累。

此外,UFLC-Triple TOF-MS/MS代谢组数据和转录组数据中发现二萜代谢途径赤霉素合成通路中的化合物与其合成酶基因均在樟脑型黄花蒿中显著上调。赤霉素是植物体内一类极为重要的激素,影响植物的生长、发育和次生代谢产物的生物合成并且受到环境因子的调控[27-30]。已有文献报道紫外线B照射和植物激素赤霉素协同促进了黄花蒿中青蒿素的积累[31],因此推测赤霉素对黄花蒿不同化学型的形成可能会有影响。

中国科学家屠呦呦从黄花蒿中提取青蒿素,拯救了全球数百万人的生命,这是中医药献给世界的一份礼物[32]。然而,黄花蒿还含有丰富的挥发油,具有良好的抗菌、抗炎、抗病毒作用[9]。热毒宁注射液在临床主治由上呼吸道感染(外感风热证)所致的高热、微恶风寒、头身痛、咳嗽、痰黄等症[33-34],原料药中的青蒿药材来源于江苏盱眙青蒿基地,制剂中青蒿药材的质控以蒿酮为主[11]。本研究综合HS-GC-QQQ-MS/MS、UFLC-Triple TOF-MS/MS和转录组数据,分析了黄花蒿2种化学型挥发性成分相关的萜类代谢物及其相关基因表达差异,以及推测其形成原因,为揭示黄花蒿化学型形成机制提供了初步的实验基础,有关黄花蒿化学型产生的生物学机制有待深入研究。

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