强骨合剂通过Wnt3a/β-catenin/VEGF信号通路促进血管生成改善围绝经期大鼠骨质疏松的研究

王雨辰,芮立宁,贾川,俞伟忠

(南京中医药大学武进附属医院,江苏 常州 213161)

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)是围绝经期妇女常见的一种与年龄相关的代谢性骨病,表现为绝经后骨密度极度降低,在我国50岁以上人群的患病率为20.7%[1-2]。PMOP患者会出现腰腿酸痛、四肢无力、驼背、易骨折等症状。近年来,PMOP的发病率逐年上升,具有高发病率、高致残率、高病死率等特点,严重影响患者的生活质量,给家庭和社会带来沉重的经济负担[3]。现代医学疗法和临床药物治疗PMOP均有效。然而,激素替代疗法(HRT)、非激素药物疗法等针对PMOP的现代医学疗法存在诸多缺陷,如副作用多、费用高、癌症风险、药物依赖等[4]。双膦酸盐类、降钙素类等药物也存在肾损害风险、依从性低、不良反应多等不足。临床上仍缺乏安全、有效、成本低且可耐受的PMOP治疗方法。因此,探究PMOP发病机制、寻求有效的治疗措施已成为医疗关注的重点之一。

尽管对PMOP的研究备受关注,但其发病机制尚未完全阐明。研究表明,PMOP发病主要与绝经后女性卵巢功能、雌激素水平下降有关。卵巢功能与雌激素水平的下降会导致下丘脑-垂体-卵巢轴功能障碍,进而影响骨代谢。骨代谢过程涉及信号传导、基因表达转录调节、激素等调控。其中Wnt/β-catenin信号通路在骨代谢以及成骨细胞介导的骨形成中发挥重要作用[5]。此外,充足的血液是骨再生的关键,因此血管生成对于骨发育和生长等生理过程极为重要。利用冲击波刺激成骨细胞促进血管内皮生长因子(VEGF)的表达,可以刺激血管生成,进而促进骨再生[6]。最新研究表明,Wnt/β-catenin通路可通过调控内皮祖细胞中VEGF表达,促进其成血管分化及血管新生能力[7]。

中医药可辨证论治PMOP，具有疗效佳、毒副作用小等优点,已经逐渐被广大患者所认可。PMOP属中医“骨痿”范畴。中医认为肾虚血瘀是PMOP的主要病机,治疗应以补肾为主,兼以活血化瘀、通络止痛。强骨合剂是临床经验方,以补肾活血中药为主,主要含龟甲、补骨脂、骨碎补、枸杞子、肉苁蓉、川牛膝、淫羊霍、杜仲、黄芪、山药、熟地、当归、丹参、煅龙骨、煅牡蛎、炙甘草等,可有效缓解骨质疏松症患者症状,但其在PMOP防治中的作用及其机制尚未见报道。本研究拟通过去卵巢法建立PMOP大鼠模型,灌胃给予强骨合剂进行干预,通过观察其子宫指数、骨密度、骨力学性能指标、股骨病理形态改变及股骨组织中VEGF、CD31以及Wnt3a/β-catenin信号通路关键蛋白表达变化,探究强骨合剂对PMOP的治疗作用机制,以期为PMOP临床治疗提供理论依据和有益参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级3月龄雌性SD大鼠50只(230～270 g),购于斯贝福(北京)生物技术有限公司,动物生产许可证号:SCXK(京)2019-0010。动物分笼饲养,自由进食、饮水,室温为20～25 ℃,每日光照12 h。动物适应性饲养1周后用于实验。随机分为假手术组、模型组、雌二醇组(100 μg·kg-1)、强骨合剂低剂量组(6 g·kg-1)、强骨合剂高剂量组(12 g·kg-1),每组10只大鼠。

1.2 药材提取

取龟甲15 g,枸杞子15 g,骨碎补15 g,补骨脂15 g,肉苁蓉15 g,川牛膝12 g,淫羊霍15 g,杜仲15 g,黄芪12 g,山药12 g,熟地12 g,当归12 g,丹参12 g,煅龙骨20 g,煅牡蛎20 g,炙甘草6 g,加入10倍量的水煎煮1 h,煎煮2次,纱布滤过,水提液浓缩至生药量1 g·mL-1。

1.3 色谱条件

取强骨合剂提取液5 mL,用2倍水稀释,加入10 mL乙酸乙酯萃取,取上清用蒸发皿挥发后加入2 mL甲醇复溶用于指纹图谱分析。

HPLC分析采用Waters 2695 Alliance HPLC系统,配备2998 DAD检测器和Empower软件数据处理软件。所有分析均采用Waters C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),进样量为10 μL,柱温30 ℃,DAD检测波长为300 nm。流动相由A(乙腈)和B(0.5%乙酸水溶液,v/v)组成,梯度洗脱条件如下:0～30 min,5%～24%A,30～31 min,24%～35%A,31～43 min,35%～50%A,43～45 min,50%～100%A,流动相流速1.0 mL·min-1。采用专业软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004年A版),提取10批次被测样品的HPLC-DAD色谱数据并分析,评价相似度。

1.4 PMOP大鼠模型的建立

采用双侧卵巢切除法制备大鼠PMOP模型[8-9]。大鼠经氯胺酮肌肉注射麻醉后固定,皮肤消毒,从腰背部脊柱两侧切开皮肤及肌肉,切口长度约1 cm,打开腹腔,找到卵巢。假手术组大鼠仅切除双侧卵巢皮下脂肪,实验各组行双侧卵巢切除术, 缝合并消毒。术后肌肉注射青霉素(80万 U，4 mL 生理盐水,1.6 mL·kg-1),连续注射3 d。术后7 d开始给药,假手术组和模型组以等量的生理盐水灌胃,实验组分别灌胃给予雌二醇(100 μg·kg-1)、低剂量强骨合剂(6 g·kg-1)和高剂量强骨合剂(12 g·kg-1),连续给药30 d。各组于最后1次给药24 h后取血,处死大鼠取骨组织和子宫组织。实验期间,每周记录各组大鼠体质量,并根据变化相应调整给药量。

1.5 子宫指数的测定

取材时用电子天平测定各组大鼠子宫湿质量,计算子宫指数。子宫指数=子宫质量(mg)/体质量(g)。

1.6 大鼠骨密度测定

处死大鼠后取出完整股骨。各组大鼠离体股骨骨密度采用双能X线骨密度分析仪(美国Lunar公司)测定。骨密度值以单位面积骨矿物质含量表示(g·cm-2)。

1.7 骨生物力学检测

采用MTS Acumen3型生物力学测试系统检测各组大鼠离体股骨生物力学性能,绘制载荷-变形曲线,计算出最大载荷、弹性模量、屈服载荷。

1.8 股骨组织病理形态检测

各组大鼠左股骨组织用多聚甲醛固定,经10%EDTA溶液脱钙、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后,行股骨石蜡切片和HE染色。光镜下观察各组大鼠股骨组织病理形态。

1.9 大鼠骨组织VEGFR-2、CD31蛋白表达检测

免疫荧光实验检测股骨组织内皮细胞的分子标记CD31以及血管内皮生长因子受体VEGFR-2表达情况。骨组织用4%多聚甲醛固定,经通透化处理、封闭、1% BSA稀释的CD31和VEGFR-2抗体孵育过夜、二抗避光孵育30 min、DAPI染核、封片剂封片后荧光显微镜观察。采用ImageJ进行荧光共定位分析,并对CD31+VEGFR-2+细胞荧光强度进行量化和统计。

1.10 qPCR检测

采用TRIzol试剂盒提取各组股骨组织总RNA,使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix将RNA逆转录为cDNA,进行qPCR扩增,GAPDH作为内参。引物序列:Wnt3a F为5'-CGGGTTCTTCTCTGGTCCTTG-3',R为5'-CTGACAGTGGTGCAGTTCCA-3';β-catenin F为5'-ATCATTCTGGCCAGTGGTGG-3',R为5'-GACAGCACCTTCAGCACTCT-3';VEGF F为5'-CAGAAGGGGAGCAGAAAGCC-3',R为5'-CTTCATCATTGCAGCAGCCC-3';OPG F为5'-CACAACCGAGTGTGCGAATG-3',R为5'-AAGTGAGCTGCAGTTGGTGT-3';GAPDH F为5'-TGGTGCTGAGTATGTCGTGG-3',R为5'-GGTTCACACCCATCACAAAC-3'。反应条件:95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共39个循环。2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

1.11 Western blot检测

用RIPA裂解液提取股骨组织总蛋白。蛋白经BCA法定量后,取20 μg上样,10% SDS-PAGE分离蛋白,半干法电转膜,然后用5%脱脂奶粉封闭。分别加入抗体VEGF(1∶1 000,Abcam)、Wnt3a(1∶1 000,Abcam)、GSK3β(1∶800,Abcam)、p-GSK3β(1∶800,Abcam)、β-catenin(1∶5 000,Abcam)、Lamin(1∶800,Abcam)、β-actin(1∶5 000,Abcam)孵育过夜。PBST洗涤后,加入二抗室温下孵育2 h。PBST洗涤后,加入化学发光试剂,化学发光成像系统进行显影成像,Image J软件对各检测蛋白的条带灰度值进行分析,计算相对表达量。

1.12 统计学处理

2 结果

2.1 强骨合剂HPLC指纹图谱分析

使用10批次样本建立强骨合剂指纹图谱,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件进行峰匹配,得到对照谱图。所有10个样品中出现的峰被定义为“共有峰”,共有10个共有峰。根据标准品定性,指认9号峰为丹酚酸B(图1)。10批次提取的复方指纹图谱分析结果相似度均大于0.9,表明10批样品质量稳定、相似。

图1 10批强骨合剂样品(S1～S10)的HPLC指纹图谱(A)及其共有模式(B)

2.2 强骨合剂对PMOP大鼠体质量和子宫指数的影响

由图2A～B可知,与假手术组相比,大鼠行卵巢切除术后,体质量显著增加,子宫指数明显下降(P<0.01)。给予雌二醇和强骨合剂干预后,与模型组比较,各用药组大鼠体质量均显著下降(P<0.01),子宫指数显著增加(P<0.05,P<0.01)。

注：与假手术组比较，##P<0.01;与模型组比较，

2.3 强骨合剂对PMOP大鼠离体股骨头骨密度和生物力学指标的影响

各组大鼠股骨头骨密度检测结果(图2C)表明,与正常组相比,模型组大鼠骨密度显著降低(P<0.01)。与模型组比较,雌二醇和强骨合剂组骨密度均升高(P<0.01)。此外,本研究对PMOP大鼠股骨的生物力学性能进行了观察。与假手术组相比,模型组大鼠弹性模量、最大载荷、屈服载荷均明显下降(P<0.01),与模型组相比,雌二醇组和强骨合剂组大鼠弹性模量、最大载荷、屈服载荷升高(P<0.01)。该结果说明去除卵巢可明显降低大鼠股骨的生物力学性能,强骨合剂干预可有效提高股骨的力学强度,改善股骨的生物力学性能(图2D～F)。

2.4 强骨合剂对PMOP大鼠股骨组织病理形态的影响

由图3所示,假手术组大鼠骨小梁基本结构正常,网状结构清晰、排列有序;模型组大鼠骨小梁断裂、不完整、间距扩大,骨小梁数量明显减少。与模型组比较,强骨合剂低、高剂量组骨小梁结构完整、排列较规则有序,接近正常。该结果表明强骨合剂可明显改善摘除卵巢所致的股骨组织病理变化。

图3 各组大鼠股骨组织病理形态(HE,×20)

2.5 强骨合剂对血管生成相关蛋白VEGFR-2和CD31表达的影响

VEGF作用于内皮细胞,具有促进新生血管生长的作用。本研究通过免疫荧光实验研究了VEGFR-2和内皮标记蛋白CD31的共定位变化。结果显示,PMOP模型大鼠CD31和VEGFR-2蛋白荧光强度较假手术组均明显减弱(P<0.01),而强骨合剂则可显著促进股骨组织CD31和VEGFR-2蛋白表达(P<0.01)(图4)。

注：与假手术组比较，##P<0.01;与模型组比较，

2.6 强骨合剂对骨组织Wnt3a、β-catenin、VEGF、OPG mRNA水平的影响

qPCR实验结果表明,与假手术组相比,模型组大鼠股骨组织中的Wnt3a、β-catenin、VEGF、OPG的mRNA水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,雌二醇和强骨合剂高剂量组Wnt3a、β-catenin、VEGF、OPG的mRNA表达水平明显升高(P<0.01),提示强骨合剂激活骨细胞Wnt3a/β-catenin信号通路,促进VEGF表达和血管生成(图5)。

注：与假手术组比较，##P<0.01;与模型组比较，

2.7 强骨合剂对骨组织VEGF、Wnt3a、p-GSK3β、GSK3β、β-catenin蛋白表达水平的影响

为明确强骨合剂对血管生成以及股骨组织中Wnt3a/β-catenin信号通路相关蛋白VEGF、Wnt3a、p-GSK3β、GSK3β、β-catenin表达的影响,我们采用Western blot法对各组相关蛋白水平进行检测。如图6所示,模型对照组大鼠股骨组织中VEGF、Wnt3a、p-GSK3β/GSK3β、β-catenin/Lamin蛋白表达含量较假手术组均显著降低(P<0.01);雌二醇组、强骨合剂高、低剂量组股骨组织中VEGF、Wnt3a、p-GSK3β/GSK3β、β-catenin/Lamin蛋白表达含量均较模型组显著升高(P<0.05,P<0.01),强骨合剂高剂量组与阳性药雌二醇组蛋白表达量升高最为显著。

注：与假手术组比较，##P<0.01;与模型组比较，

3 讨论

PMOP是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的致使骨的脆性增加,以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病,多见于绝经后的妇女[10]。随着社会老龄化,PMOP的发病率逐年上升,已成为全球关注的重要健康问题[11]。雌激素水平下降,引发了破骨细胞的激活与分化,从而进一步引起骨吸收亢进[8]。骨吸收亢进目前被认为是绝经后骨质疏松症骨量丢失的最重要病因[9]。由于雌激素匮乏在绝经后骨质疏松症中的核心作用,雌激素和双膦酸盐等抗骨吸收药物作为首选治疗药物,临床疗效已被证实[12-13]。但多种副作用限制这些药物的推广应用[14-15]。雌激素作为绝经后骨质疏松症防治一线药物,长期服用可增加雌激素依赖性肿瘤和心血管疾病风险[16];双膦酸盐是迄今为止最有效骨吸收抑制剂之一,但大样本临床研究发现,此类药物长期使用导致成骨不全、不典型骨折[17]。由于缺乏安全有效的治疗方法,探索PMOP的机制和寻找新的治疗策略尤为重要。

PMOP属中医“骨痿”范畴。《医经精义》中论述“肾藏精,精生髓,髓生骨”,表明肾与骨密切相关。肾气充足,则骨质紧密;肾气不足,则髓枯骨痿,即骨质疏松。同时,绝经后妇女气血虚少,血液瘀滞,脏腑濡养不足,骨骼失养,发为“骨痿”。因此,中医学认为“肾虚”是PMOP的根本病机,血瘀是发病的关键机制,因而确立了以补肾活血化瘀为PMOP的根本治疗法则。强骨合剂是南京中医药大学武进附属医院骨伤科名中医李云峰教授根据家传验方进行改进的复方制剂,具有10余年临床应用经验,患者反应疗效显著。此方是基于“本痿标痹”的病机本质深入认识拟定的临床验方,主要由川杜仲、骨碎补、补骨脂、淫羊霍、肉苁蓉、龟甲、地黄、枸杞等中药组成。其中主要药物组成来源于《妇人大全良方》中的“三痹汤”,主要取三痹汤温肾除痹之力。原方用于妇人血气凝滞,手足拘挛，其适应症与绝经后骨质疏松症的下肢无力和腰背疼痛甚为类似。肾气为督脉之本,强骨合剂中又融合了宋代《太平惠民和剂局方》仙灵脾散,取其淫羊藿与骨碎补药对,增强补益肾气,活血通痹之功。该方总体立意以骨碎补、淫羊藿等补肾壮骨,配伍丹参、牛膝等中药活血通络。前期临床研究显示[18-19],该方药物安全性良好,且能显著改善老年骨质疏松症患者腰膝酸软无力、站立行走不便、头晕目眩等“骨痿”证候,也能明显缓解长期反复骨痛的“骨痹”症状。前期临床研究初步证实[20-22],本方可调节肾虚血瘀型老年骨质疏松患者骨代谢生化指标,抑制骨吸收速率,明显提高骨密度。虽然强骨合剂作为治疗骨质疏松症安全有效的临床复方,其抑制骨质疏松骨吸收亢进的机制仍不明确。

Wnt/β-catenin通路是重要的骨形成调控通路,在骨骼稳态和骨修复中发挥着关键作用。人类Wnt的功能获得性突变会导致高骨量表型,例如van Buchem病。相比之下,功能丧失性突变会导致骨质减少性疾病,例如骨质疏松性假神经胶质瘤综合征[23]。研究表明,Wnt信号通过维持干细胞的自我更新和增殖、诱导分化和减少骨祖细胞的凋亡来调节骨量[24-25]。此外,β-catenin干细胞诱导成骨细胞形成,通过直接刺激Runx2基因表达减少成熟成骨细胞的凋亡[25-26]。在骨质疏松症患者中,低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)的功能丧失突变[27]。去卵巢大鼠雌二醇、LRP5、Runx2和β-catenin水平降低,提示Wnt/β-catenin信号通路可能参与了绝经后骨质疏松症的发病[28]。此外,经典的Wnt/β-catenin轴是一种进化上保守的信号通路,它被Wnt配体激活,在血管生成的调节中起着关键作用[29]。当Wnt/β-catenin通路被激活时,β-catenin会从N末端的GSK3β的丝氨酸和苏氨酸磷酸化中逃脱,破坏复合物的稳定性[30-31]。因此,β-catenin在细胞质中积累并转移到细胞核中,调节Wnt靶基因的表达[32-33]。多种促血管生成介质如VEGF是已知的Wnt靶点,其启动子包含β-catenin反应元件。研究发现,在VEGF启动子转录起始位点上游805 bp处的T细胞因子4(TCF-4)结合元件是这种效应的重要介质[34-35]。众多文献已表明,通过Wnt/β-catenin通路可调节VEGF和血管形成[36]。

本研究结果显示,强骨合剂组、雌二醇对照组大鼠的子宫指数、骨密度和骨生物力学性能均显著高于模型组。强骨合剂明显改善去卵巢模型大鼠股骨组织病理形态变化,显著提高股骨组织中Wnt3a、β-catenin、VEGF、OPG mRNA水平,以及VEGF、CD31、Wnt3a、p-GSK3β、β-catenin蛋白表达水平。这些结果表明强骨合剂可有效改善围绝经期大鼠骨质疏松症状,改善骨生物力学,其具体的机制可能是通过调控Wnt3a/β-catenin/VEGF通路促进血管生成实现的。

综上所述,强骨合剂可能通过正向调控Wnt3a/β-catenin信号通路,促进VEGF生成,促进血管生成,提高骨密度,改善骨组织形态,从而发挥对骨质疏松症的治疗效果,但具体的分子机制还需进一步的深入研究。此外,中药复方具有多成分、多途径、多靶点的作用特点，除了Wnt3a/β-catenin/VEGF信号通路外,是否还有其他信号通路参与到强骨合剂的药理效应中?这亦需通过进一步的实验证实。