毛细管电泳法测定鱼肉组织中的诺氟沙星和环丙沙星

田慧勇，李晓娜*，杨宇燕，黄藤波，李广鹏，甘慧

（1.深圳市通量检测科技有限公司，广东 深圳 518102；2.广东省检迅检测科技有限公司，广东 东莞 523843；3.深圳市深业航天食品与环境检测科技有限公司，广东 深圳 518100；4.深圳市汇知科技有限公司，广东 深圳 518101）

氟喹诺酮类药物（FQs）是人造非甾体抗生素[1]。诺氟沙星（NOR）用于治疗由弯曲杆菌、大肠杆菌、志贺氏菌和霍乱弧菌引起的疾病，也可治疗淋病、眼部感染和尿路感染[2]。环丙沙星（CIP）则用于治疗全身感染，包括尿路、呼吸道、胃肠道和皮肤感染，其通过抑制细菌DNA螺旋酶的一个亚蛋白来影响细菌的生长和繁殖[3]。这些喹诺酮类药物也经常被用作饲料添加剂[4]，其广泛使用对人类的健康构成潜在危害，如耐药菌株的出现或可诱发癌症[5]。对药物残留进入食物链并导致细菌耐药性的担忧促使欧盟和中国建立了各类抗生素的最大残留水平[6]。

近年来已报道了几种测定诺氟沙星和环丙沙星的方法，其中包括高效液相色谱法[7]、流动注射化学发光法[8]、电化学方法[9]和分光光度法[10]。高效液相色谱法系统复杂、维护复杂、样品用量大、试剂昂贵限制了其应用。化学发光法和分光光度法不能用于测定复杂生物样品中的氟喹诺酮类药物，因为它们分离效率太低。近年来毛细管电泳法因其简单、高效、对溶剂和样品的要求不高、成本相对较低，在生物样品的定量分析中引起了广泛关注[11]。通过液-液萃取或固相萃取（SPE）的方法处理样品，过程复杂、耗时且需要大量有机溶剂。基质固相分散前处理方法（MSPD）基于SPE，其中基质的均匀分散体与合适的固体吸附剂（硅胶、硅藻土、氧化铝、C18等）混合。该方法已成功从鱼肉组织中提取诺氟沙星和环丙沙星，与其他方法相比MSPD需要的分析时间更短、样本量更小、消耗溶剂更少[12]。

本试验建立了一种同时测定鱼肉组织中诺氟沙星和环丙沙星残留的毛细管电泳（CZE）方法。MSPD用于从鱼肉组织中提取诺氟沙星和环丙沙星。本试验重点是MSPD前处理及毛细管电泳分离效率的参数优化，最后将该方法用于实际样品中诺氟沙星和环丙沙星的分析，取得了较好的结果。

1 材料和仪器

1.1 主要试剂与材料

诺氟沙星和环丙沙星标准品购自中国标准物质研究中心。甲醇（AR）、甲苯（AR）、氯仿（AR）和乙腈（AR）够自北京化工厂，硼酸（H3BO3）（AR）和氢氧化钠（NaOH）（AR）购自天津化学试剂总厂，硅藻土（Florisil，200目）、二氧化硅（200目）购自中国医药生物制品研究所。YWG-C18-（C18-）和YWG-C8-（C8-）键合二氧化硅材料（表面积300 m2/g、平均孔径10μm）购自中科安泰科技有限公司。草鱼购自深圳市宝安区某超市。

1.2 主要仪器设备

冷冻离心机购自美国eppendorf；M3 basic涡旋仪和Topolino磁力搅拌购自德国IKA；TP-213 电子天平购自美国 DENVER Instrument；DHG-9140A 电热恒温干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司；DF-101S恒温加热器购自巩义市予华仪器有限责任公司；毛细管电泳仪（型号：PA800）购自美国Beckman Coulter；该仪器配备紫外线（UV）检测器，自带32K 8.0软件进行数据采集和仪器控制。Milli-Q水净化系统购自美国Millipore，18.2 MΩ·cm超纯水经0.22μm过滤膜过滤使用。

2 试验方法

2.1 固相萃取材料的制备

先将Florisil、二氧化硅、C18和C8在650℃下烘焙后干燥5小时，再于100℃下干燥2小时后，储存于干燥器中以备将来使用。

2.2 MSPD方法前处理

MSPD的步骤参见文献[13]。约0.02 g草鱼腹部肉在2 mL NaCl（1 mol/L）中均质，转移到玻璃砂浆中，然后浸泡在适量的标准溶液中。10分钟后将1.0 g C18（分散吸附剂）与样品混合。将均匀混合物装入预先包装有0.2 g C18颗粒的针筒中。用3.0 mL甲醇-H2O（1∶19，v/v）冲洗针筒，并用3.0 mL乙腈洗脱。洗脱液在50℃下氮气旋转蒸发。干残渣用200 μL流动相缓冲液复溶后，上机待测。

2.3 CE色谱条件

未处理的的石英毛细管（60 cm×75 μm）需进行活化，用0.1 mol/L NaOH溶液冲洗30分钟，Milli-Q纯净水冲洗30分钟，然后用流动相缓冲液浸泡30分钟。40 mmol/L的硼酸溶液用NaOH调节至pH 8.5作为流动相，施加16 kV的电压进行分离。通过液体冷却系统使毛细管的温度保持在25℃。在1.0 psi的压力下2 秒钟将缓冲液注射，在280 nm紫外检测器中进行检测。

3 结果与讨论

3.1 MSPD前处理优化

在萃取前将诺氟沙星和环丙沙星添加到空白的鱼肉组织中，使其终浓度为10 μg/g。均质、混合后研究四种吸附材料（Florisil、二氧化硅、C8和C18）的回收率，结果见表1。四种吸附剂性能的比较表明，C18的吸附效率显著优于二氧化硅、Florisil和C8，其原因可能为C18的极性与目标分析物相似。C18作为分散吸附剂时，两种目标分析物的回收率最高，分别为87.8%和92.3%。当使用其他吸附剂时，两种目标分析物的回收率较低，且干扰分析物检测的峰较多。因此，选择C18作为最佳分散吸附剂。

表1 不同吸附剂对诺氟沙星和环丙沙星回收率的影响(n＝3)

由于MSPD前处理是一个复杂的过程，并且根据样品的性质，如极性、溶解度、pKa等，应仔细选择洗涤和洗脱溶剂。以甲苯、氯仿、甲醇和水为备选洗涤溶剂，研究了MSPD中的洗涤步骤，以提高MSPD的选择性并降低交叉反应。以甲醇-H2O（1∶19，v/v）为洗涤溶剂时，洗涤效果最好。当甲醇-H2O的体积小于3.0 mL时，观察到内源性成分的干扰。然而当甲醇-H2O的体积大于3.0 mL时回收率降低。因此选择3.0 mL甲醇-H2O（1∶19，v/v）为洗涤剂。此外还研究了水、甲醇和乙腈等洗脱溶液，以3.0 mL乙腈为洗脱液，诺氟沙星和环丙沙星的回收率最佳。

3.2 色谱条件的优化

电解质浓度对分离性能有显著影响，因为它会影响焦耳热、电渗流量、离子强度、电解质粘度以及毛细管中产生的电流。因此电解质浓度会影响保留时间和峰面积。对不同硼酸盐浓度（10 ～70 mmol/L）进行了研究，结果见图1。将缓冲溶液的pH值调整至8.5，并将两种目的分析物的浓度为10.0 μg/g时，当硼酸盐浓度从10 mmol/L变化至40 mmol/L，分析物的峰面积逐渐增加；当硼酸盐浓度高于40 mmol/L时，峰面积显著减小，分析时间显著增加，保留时间延长。因此最佳硼酸盐浓度为40 mmol/L。

图1 缓冲液浓度对峰面积的影响

由于诺氟沙星（pKa1 6.1，pKa2 8.5）和环丙沙星（pKa1 6.1，pKa2 8.7）是两性离子化合物[20]，缓冲液pH不仅影响电渗流量，还会影响两种分析物的存在形式。本试验研究了缓冲液pH值对两种分析物分离的影响，结果见图2。当硼酸盐的浓度为40 mmol/L时，两种分析物的浓度为10.0 μg/g时，结果表明峰面积随着pH值从6.5～8.5增加而增加。然而当pH值大于8.5时，峰面积几乎不变，但保留时间延长，原因是分析物以阴离子的形式存在。当pH值高于8.5时，它们在280 nm波长处具有最大的吸光度。因此在后续研究中缓冲液流动相的pH值为8.5。

图2 缓冲液pH值对峰面积的影响

在10～20 kV范围内对电压的优化。随着外加电压的增加，保留时间缩短，峰面积增加，但分辨率降低，实验选择了16 kv的外加电压，该电压下具有良好的灵敏度和保留时间。

表2 诺氟沙星和环丙沙星在鱼肉组织中的标准曲线、检出限和定量限

3.3 标准曲线、检出限和定量限

通过在空白鱼肉组织样品中添加不同浓度的诺氟沙星和环丙沙星来绘制标准曲线。在0.10～500 μg/g的浓度范围内，获得了鱼肉组织中诺氟沙星和环丙沙星的线性校准曲线，相关系数R2分别为0.9994和0.9986。诺氟沙星和环丙沙星的检出限（LOD）（信噪比为3，S/N＝3）分别为0.04 μg/g和0.03 μg/g，诺氟沙星和环丙沙星的定量限（LOQ）（信噪比为3，S/N＝10）分别为0.12 μg/g和0.10 μg/g。欧盟确定在肉类中的诺氟沙星和环丙沙星的最大残留限量为100 μg/kg[14]。因此，该方法具有足够的灵敏度，可以应用于鱼肉组织中。

3.4 样本分析

将不同浓度（0.50 μg/g、2.00 μg/g和10.00 μg/g）的诺氟沙星和环丙沙星加标到空白鱼肉组织中，考察了该方法的回收率和精密度。表3总结了日内和日间精密度和准确度实验的结果。在本试验中，诺氟沙星的精密度在中浓度和高浓度水平下通常小于5.6%，在低浓度水平下不超过6.8%，回收率始终在86.4%到105.2%之间。环丙沙星在中、高浓度水平下的精密度＜5.1%，在低浓度水平下的精密度不超过6.2%，回收率在90.1%～103.6%之间。该方法的回收率和精密度都优于ELISA方法。图3显示了从空白和加标鱼肉组织样品中的毛细管电泳谱图。

图3 毛细管电泳谱图

表3 诺氟沙星和环丙沙星在鱼肉组织中的精密度和回收率（n=9）

4 结论

本试验建立了一种利用MSPD前处理方法并通过毛细管电泳法测定鱼肉组织中诺氟沙星和环丙沙星的方法，研究了样品前处理方法的条件。对毛细管电泳条件也进行了参数优化：选择合适的缓冲液浓度、pH值和电压等；并对方法的线性关系、检出限、加标回收等进行了系统的考察。试验表明：该方法具有前处理简单、污染小、检测结果准确、可靠等优点，可以用于大批量鱼肉制品中诺氟沙星和环丙沙星残留的检测，为国家标准的制定提供技术参考。