锦鲤人工感染SVCV后血液生化指标监测及在疾病诊断中的应用分析

刘文珍，田飞焱，花麒，欧阳敏

（1.江西省农业技术推广中心，江西 南昌 330046；2.江西省水产科学研究所，江西 南昌 330039；3.江西省水生生物保护救助中心，江西 南昌 330046）

鲤春病毒血症病毒（SVCV），是一种弹状病毒，在春季常能够引起鲤科、鲶科鱼类大规模爆发鲤春病毒血症（SVC）[1]。SVC主要表现为急性出血和流行性败血症，传染快，死亡率高，曾在欧洲、美国、日本流行，染病鱼类死亡率高达90%以上，可造成巨大的经济损失[2][3]。SVC在世界范围内流行，由于该病对水产业的发展可造成极大的威胁，世界动物卫生组织（OIE）将该病列为必须申报的疫病[4]，我国也于2008年将该病列为一类动物疫病。

SVCV的宿主范围很广，能感染四大家鱼和其他几种鲤科鱼类以及某些非鲤科鱼类，如鲤鱼。其中鲤鱼是最主要的、最易感染的宿主。但迄今为止，对SVC的研究仅局限于病原学、流行病学调查、检测与诊断以及单基因水平的分子学生物研究，而关于其感染后的血液生化指标研究还很少，本文中就用实验室分离出来的一株SVCV对锦鲤进行人工感染，引发其病症，测定该锦鲤的血液生理生化指标，以期为锦鲤的鲤春病毒血症的病理学研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

用于人工感染试验的试验鱼购自于分宜县某养殖场，为体长在11～15 cm健康锦鲤（Cyprinus carpio koi）；水族箱用循环水中暂养5 d，无异常后开始试验。SVCV病毒株是本实验室利用草鱼卵巢细胞系从一批鲫监测样品中分离鉴定到的一株病毒，为JX14-012株。

1.2 方法

1.2.1 人工感染

试验前随机抽取该批锦鲤25尾，取肝、脾、肾和脑按前述方法进行病毒分离和PCR检测，确定试验鱼为SVCV阴性样本。然后将剩下的鱼随机分成4组，每组15尾，暂养于室内水循环养殖系统的4个水缸中，水温为8℃～16℃。以JX14-012株的细胞悬液作原液，并将原液用含10%胎牛血清的M199以1∶10倍、1∶100倍稀释，共3个梯度的攻毒液通过腹腔注射试验组，同时用正常的CO细胞悬液注射另一组作为对照组，每尾注射0.2 mL，每天观察各组试验鱼的发病死亡情况，试验过程中开增氧机、不开循环水。为了验证第一次感染试验的试验结果，又进行了第二次感染试验，将原液用含10%胎牛血清的M199以1∶10倍、1∶100倍稀释，共3个梯度的攻毒液通过腹腔注射试验组，同时用正常的CO细胞悬液注射另一组作为对照组，每尾注射0.2 mL。

1.2.2 血液生化指标测定

用无菌注射器（1 mL）进行尾静脉取血，置于1.5 mL离心管中，用低温冷冻离心机，10000 r/min离心10 min，收集血清，分别测定健康锦鲤、受感染2 d和9 d的锦鲤血清中的总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、总胆固醇（TC）、尿素氮（BUN）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转移酶（GGT）、尿酸（UA）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酐（CREA）、葡萄糖（GLU）、球蛋白（GLB）。所有生化指标均在URIT-8026生化自动分析仪上完成。第二次感染试验感染6 d后（出现明显症状甚至死亡）抽血测定以上相同指标。

1.2.3 数据处理

本实验数据均通过Spss 24软件进行统计分析。进行ANONA分析，多重比较，P＜0.05即认为差异显著，所有的数据结果以样本平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 临床症状

感染SVCV的鱼类一般有以下症状：在池塘进水口聚集、活力下降、呼吸困难；随后病鱼出现反应迟钝、游速减慢、身体平衡能力降低，有些在池塘边缘无方向性的游动或无意识漂游；发病后期病鱼几乎停止游动，身体倾斜，经常卧于池底[5，6]；病鱼体色发黑、眼球突出、鳃部苍白等，眼球和体表有出血斑点，肌肉呈红色[4]。在本试验中注射感染的锦鲤在第6天开始出现典型症状，主要表现为全身出血，眼球突出（图1）、解剖病鱼，发现鳔充血较为明显，肛门红肿，腹腔积水、肝脾肾肿大（图2）。而对照组鱼无病症。

图1 体表、鳃盖、头部充血现象

图2 鳔充血症状

2.2 感染SVCV对锦鲤血清生化指标的影响

由表1可知，人工感染后，与健康组相比较，TBIL、DBIL、TC、ALT、AST、ALP、GGT均无显著性差异，但仍然能从表中看出一些变化的规律，其中TBIL、DBIL在血清中的含量在感染2 d时有稍微的上升，在感染9 d后则有所下降，ALT、AST、ALP则均在感染2 d时数值变化不大，感染9 d后则含量有所上升。

表1 健康鱼与人工感染后鱼的血液生化指标的比较

TP、ALB、GLB、HDL、LDL均在感染后浓度有所下降，但没有显著性差异，而是感染9 d后，血清中含量显著下降，与健康组相比较有显著性差异（P＜0.05）。

TG、UA则在感染2 d后浓度迅速上升，尤其是原始浓度感染组和稀释10倍原液感染组，与健康组相比较有极限性差异（P＜0.01），但在感染后期，则其浓度极大的降低到与健康组浓度差异不大。

LDH、CREA、GLU均在感染初期变化不明显，但在感染9 d后，含量均极显著升高。

BUN在感染2 d后其浓度就迅速下降，至感染9 d后，其浓度与健康组相比较有极显著性差异（P＜0.01）。

由表2中可以看出第二次的试验基本验证了第一次感染试验的结果，TBIL、DBIL、TC、ALT、AST、ALP、GGT、TG、UA均无显著性差异，其中TG、UA符合第一次感染试验时感染初期变化明显而感染后期变化不明显的规律。而TP、ALB、GLB、HDL、BUN含量则显著下降，LDH、GLU、CREA在感染后含量显著上升，均与第一次感染试验结果一致。

表2 第二次感染试验后锦鲤的血液生化指标比较

3 讨论

3.1 关于血液生化参数变化及生理意义的分析

综合两次感染试验可以看出，在感染初期（2 d左右），与正常值相比较，只有TG、UA、BUN三个指标变化明显，其中UA、TG后期并无显著性变化，因此建议可以使用TG、UA、BUN三个指标做为SVC疾病初期的诊断参考指标。而在感染后期（6～9 d），与正常值相比较，TP、ALB、GLB、HDL、LDH、GLU、CREA均有明显变化，可以做为SVC疾病后期的诊断参考指标，此时有些锦鲤也开始出现一些典型症状，这与锦鲤血液生化指标的变化相对应。

3.2 个别参数变化及生理意义分析

如，锦鲤受到病毒攻击，肌肉充血，肌肉组织受到破坏，肌酸代谢产物CREA在血清中含量明显增加，表明肌肉组织受损严重。LDH含量增高，也是锦鲤肌肉组织受损的表征，这能加速受感染锦鲤的死亡。血液中的ALB主要功能是维持血液的渗透压，GLB主要参与脂类和溶脂类物质的运输以及机体免疫反应。而两者之和的TP是机体蛋白质的来源，常用于修补组织和能量补给。本试验中TP、白蛋白、球蛋白均在感染后浓度下降，尤其是感染9d后，血清中含量显著下降，与健康组相比较有显著性差异，这说明肝细胞受损蛋白质合成功能减退，这是反映鱼体受病毒攻击的重要指标。因此，检测锦鲤的血液生化指标能够在锦鲤的疾病诊断中起到重要的作用。