miR-216a调控NF-κB信号通路参与脓毒症急性肾损伤的机制

邓林林 张啸 高仪 龚园其 蓝海兵

南昌大学第二附属医院重症医学科（南昌 330000）

脓毒症是一种由感染引起全身性炎症反应的危及生命的器官功能障碍的临床综合征［1-2］。该病极易进展为脓毒性休克，一旦发病，发展速度极快，且患者预后较差，病死率极高［3-4］。其中急性肾损伤是该病最严重的并发症之一，病死率也极高。目前，该病的发病率还在逐年递增，因此研究有效的治疗手段十分关键，微小RNA（microRNA，miR）是一类非编码RNA，可以调控基因表达。有研究［5］表明，miR-216a 可以广泛的表达于心、肝、肺、肾等组织中，并且与急性胰腺炎导致的胰腺损伤存在密切的联系，且在对于炎症的控制方面具有特异性，其可以对相关炎症基因的表达进行抑制，在炎症的调控中发挥着重要的作用。但是与脓毒症急性肾损伤的关系还有待探讨，本文推测其可能作为急性损伤诊断的标志物。除此之外，有研究［6-7］指出，当人体处于缺血缺氧的状态时，炎症信号通路就会被激活，从而产生炎性因子导致急性肾损伤发病，而NF-κB 就是与炎症反应密切相关的常见通路；且此通路与脓毒症大鼠神经上皮细胞的凋亡和炎症反应有一定的联系［8］。但是miR-216a 是否可以调控NF-κB 改善脓毒症大鼠急性肾损伤，还并不明确。因此，本文以脓毒症大鼠作为实验对象，制备脓毒症模型，观察其炎症因子以及生化指标的表达，初步探讨miR-216a 对脓毒症大鼠急性肾损伤的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组 选取40 只在9 周龄左右的SD 雄性大鼠，体质量260 g 左右，购自北京科宇动物养殖中心，饲养于无菌环境中，温度：27 ℃左右；湿度：55%左右，自由进食，适应性喂养1 周后进行实验。然后将其随机分为：假手术组、模型组、miR-NC 组、miR-216a 组，每组各10 只。实验获得医院实验动物伦理委员会批准（编号：2017009）。

1.1.2 仪器与试剂 TRIzol RT RNA 试剂盒、反转录试剂盒、ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；显微镜（上海无陌光学仪器有限公司）；miR-216a 模拟物及对应的阴性对照（NC）模拟物（上海吉凯公司）；PCR 仪、电泳仪、酶标仪（大龙兴创实验仪器有限公司）；所需抗体（美国Thermo 公司）；组织匀浆机（深圳欣博盛生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 假手术组大鼠仅仅在开腹后分离两肾，然后关闭即可，其余大鼠参照文献［9］，以盲肠结扎穿孔法进行造模：对所有大鼠均进行麻醉，然后开腹，模型组和miR-NC 组、miR-216a 组大鼠首先脱毛、消毒，然后将右肾蒂及输尿管进行分离，然后将其结扎，左肾分离后采用夹钳将动脉闭合30 min 左右，最后进行缝合。miR-NC 组、miR-216a 组在造模成功后大鼠尾部分别注射5 μL 的miR-NC、miR-216a，模型组和假手术组注射等量生理盐水，连续注射3 d。第4 天麻醉大鼠，做后续实验。当大鼠出现寒战竖毛、蜷缩懒动、呼吸急促、进食减少、精神萎靡、眼角分泌物增多、保护性反射减弱等则表示造模成功，本实验所有大鼠均造模成功。

1.2.2 HE 染色观察大鼠组织病理变化先将大鼠麻醉，仰卧固定，打开腹部暴露脏器，小心摘取肾脏后，用生理盐水充分冲洗后再固定，流水冲洗并采用酒精脱水，再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂中，放入保温箱中。待石蜡完全浸入组织块后包埋，连续5 μm 切片，进行染色，然后采用显微镜观察各组大鼠肾组织的病理学改变。

1.2.3 PCR 检测大鼠肾组织中miR-216a 表达 提取组织总RNA，然后将其逆转录为cDNA，扩增后根据试剂盒进行PCR 检测。检测miR-216a 表达。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 生化分析仪检测各组大鼠生化指标水平 抽取大鼠静脉血液2 mL，采用生化分析仪检测大鼠血清中血肌酐（blood creatinine，Scr）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）以及肾损伤分子-1（kidney damage molecule-1，KIM-1）水平。

1.2.5 ELISA检测各组大鼠血清炎症因子水平 将各组大鼠静脉血液迅速注入EDTA 试管中混匀，离心后置于-80 ℃环境中待检，采用ELISA 法检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）的表达，严格按照说明书操作。

1.2.6 Western blot 检测各组组织的NF-κB 通路相关蛋白表达 取组织总蛋白进行测定，加入SDS-PAGE 凝胶后进行电泳，分离后进行转膜用BSA 封闭PVDF 膜1 h，脱脂封闭后加入NF-κB p65、p-NF-κB p65 抗体；吸尽一抗孵育时的洗涤液后加入稀释好的二抗慢慢摇动；再次摇动洗涤，然后凝胶成像，计算蛋白表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析；两两之间采用LSD-t检验多重比较；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肾脏组织病理改变 假手术组大鼠肾组织结构无异常；模型组和miR-NC 组肾组织伴有炎性浸润、肾间质加宽；miR-216a 组炎性浸润现象以及肾小球病变情况有所缓解，见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理学变化（200×）Fig.1 Histopathological changes in the kidney of each group of rats（200×）

2.2 测定组织中miR-216a 表达 与假手术组相比，模型组、miR-NC 组肾组织miR-216a 表达水平较低，与miR-NC组相比，miR-216a组肾组织的miR-216a 表达水平较高（P＜0.05），提示转染成功，见表2。

表2 各组大鼠肾组织中miR-216a 表达比较Tab.2 Comparison of miR-216a expression in the kidney tissue of rats in each group ±s

表2 各组大鼠肾组织中miR-216a 表达比较Tab.2 Comparison of miR-216a expression in the kidney tissue of rats in each group ±s

注：与假手术组相比，*P ＜0.05

分组假手术组模型组miR-NC 组miR-216a 组F 值P 值例数10 10 10 10 miR-216a 1.02±0.05 0.52±0.12*0.50±0.08*3.75±0.54*309.005＜0.001

2.3 测定各组大鼠肾组织生化指标 与假手术组相比，模型组、miR-NC 组大鼠血清Scr、BUN、KIM-1水平较高，与miR-NC 组相比miR-216a 组大鼠血清Scr、BUN、KIM-1 水平较低（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠肾组织中生化指标比较Tab.3 Comparison of biochemical indexes in the kidney tissue of rats in each group ±s

表3 各组大鼠肾组织中生化指标比较Tab.3 Comparison of biochemical indexes in the kidney tissue of rats in each group ±s

注：与假手术组相比，*P ＜0.05

分组假手术组模型组miR-NC 组miR-216a 组F 值P 值例数10 10 10 10 Scr（μmol/L）30.52±3.69 52.67±4.48*52.36±4.03*40.03±2.57*80.763＜0.001 BUN（mmol/L）7.63±1.69 22.05±3.69*21.08±3.74*13.48±2.58*49.862＜0.001 KIM-1（ng/L）21.07±3.05 63.17±8.63*63.47±8.41*39.74±6.12*87.393＜0.001

2.4 测定大鼠血清炎性细胞因子 与假手术组相比，模型组、miR-NC 组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平较高，与miR-NC 组相比miR-216a 组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平较低（P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠炎性细胞因子水平比较Tab.4 Comparison of inflammatory cytokine levels in each group of rats ±s

表4 各组大鼠炎性细胞因子水平比较Tab.4 Comparison of inflammatory cytokine levels in each group of rats ±s

注：与假手术组相比，*P ＜0.05

分组对照组模型组miR-NC 组miR-226a 组F 值P 值例数10 10 10 10 TNF-α（ng/mL）45.63±6.17 132.05±15.08*133.25±16.47*69.36±9.04*127.845＜0.001 IL-6（ng/mL）28.39±5.95 95.33±10.32*96.01±10.41*54.04±8.41*136.835＜0.001 IL-1β（ng/mL）40.17±6.28 106.47±10.45*105.85±10.99*71.74±9.54*117.705＜0.001

2.5 测定大鼠肾组织中NF-κB通路相关蛋白表达与假手术组相比，模型组、miR-NC 组大鼠肾组织中蛋白表达较高，与miR-NC 组相比miR-216a 组大鼠肾组织中蛋白表达较低（P＜0.05），见表5，图2、3。

图2 各组大鼠肾组织中NF-κB 通路相关蛋白表达比较Fig.2 Comparison of NF-κB pathway-related protein expression in the kidney tissues of various groups of rats

表5 各组大鼠肾组织中NF-κB 通路相关蛋白表达比较Tab.5 Comparison of NF-κB pathway-related protein expression in the kidney tissues of rats in each group ±s

表5 各组大鼠肾组织中NF-κB 通路相关蛋白表达比较Tab.5 Comparison of NF-κB pathway-related protein expression in the kidney tissues of rats in each group ±s

注：与假手术组相比，*P ＜0.05

分组假手术组模型组miR-NC 组miR-216a 组F 值P 值例数10 10 10 10 NF-κB p65 1.05±0.06 2.57±0.17*2.55±0.19*1.38±0.08*333.569＜0.001 p-NF-κB p65 1.34±0.15 2.89±0.26*2.88±0.27*1.54±0.10*160.794＜0.001

图3 NF-κB 信号通路作用图Fig.3 NF-κB signaling pathway action diagram

3 讨论

脓毒症是由各种细菌、真菌等微生物入侵到机体后引发的炎症反应，是一种全身性的反应，该病在发病过程中，机体会产生大量促炎因子从而改善炎症反应，但如果增强炎症反应的因子和减轻炎症反应的因子发生抗衡，就会损害机体；据研究［10］发现，大约30% ～50%的脓毒症患者会发生脓毒症急性肾损伤，且非常常见，而且该并发症具有病情危急、临床治疗效果不明显、病死率极高等特点。尽管目前许多抗生素都在不断升级，治疗手段也在不断改善，但是该病的治疗成本也在不断增长，且病死率依旧没有下降［11］。有研究已证实，miR-216a 已被证明与包括肺癌、乳腺癌在内的多种癌症的发病以及病情进展有关。除此之外，还有研究表明miR-216a 可以调控Ybx1-框结合蛋白1 的表达在糖尿病肾病的发生发展中起到参与作用，这提示miR-216a 或许也可以在急性肾损伤的发生发展中起到一定的调控作用［12-13］。且万笑笑［14］已经研究证实，miR-216a 可以通过调控NF-κB 信号通路抑制缺氧-复氧诱导的肾小管上皮细胞急性肾损伤。这为miR-216a 可以参与脓毒症急性肾损伤的发生发展这一结论增加了一丝可信度。因此，本文通过研究SD 大鼠，对其进行脓毒症模型建造，并对miR-216a 进行转染，结果发现miR-216a 在模型组中的表达较低，说明低表达的miR-216a 会增加大鼠肾组织的损伤，影响肾功能。此外，有研究提示，NF-κB 通路对脓毒症有调控作用。因此，本文就miR-216a 是否可以调控NFκB 信号通路作用于脓毒症大鼠进行分析。

在本研究中，首先观察了各组大鼠肾组织的病理学变化，结果显示，假手术组大鼠肾组织结构无异常；模型组和miR-NC 组肾组织伴有炎性浸润、肾间质加宽；miR-216a 组炎性浸润现象以及肾小球病变情况有所缓解。这说明miR-216a 在脓毒症急性肾损伤的并且进展中扮演着抑癌的角色，进一步证实其过表达对肾组织有一定的保护作用。Scr、BUN 是判断肾功能损害的重要指标，在急性肾损伤中会呈现高表达状态，KIM-1 也是该病的重要标志因子，在早期水平较高［15］。在本研究结果中，显示模型组、miR-NC 组大鼠血清Scr、BUN、KIM-1 水平较假手术组升高，miR-216a 组大鼠血清Scr、BUN、KIM-1 水平较miR-NC 组降低。这进一步提示过表达的miR-216a 可以降低脓毒症急性肾损伤的肾功能损害程度。众所周知［16］，TNF-α 和IL-1β 是反应机体炎症的重要指标，也是该病在发展过程中单核巨噬细胞产生的重要因子；而IL-6 是脓毒症中关键促炎因子，可以激活某些转导通路来调节脓毒症等病理条件下的多种细胞因子［17］。在本研究的ELISA 实验中，发现与假手术组相比，其余各组大鼠血清炎性因子水平较高，而与miR-NC 组相比miR-216a 组大鼠血清炎性因子水平较低。说明，miR-216a 可以减少TNF-α，IL-6 以及IL-1β 的分泌，抑制炎症联级反应，缓解炎症症状。提示过表达的miR-216a 在疾病进展过程中可以通过抑制炎症反应来保护肾脏。

王彬等［18］指出，在实验性重度急性胰腺炎组织中的TLR4、NF-κB p65 表达变化与肾损伤严重程度和促炎因子的变化一致，且认为某种激酶的负调控通过TLR4/NF-κB 信号通路减轻脂多糖诱导的小鼠急性肾脏损伤［19］。并且研究［20］发现NFκB 通路在脓毒症中有重要的参与作用，且与炎性因子水平呈负相关关系；研究还指出，当NF-κB 被激活后，进而会抑制促炎因子的表达；当正反馈调节与负反馈调节失衡时，也就是促炎反应与抗炎反应失衡时，就会引起严重的炎症反应，甚至是脓毒症，最终导致多功能障碍综合征［21-22］。而在本研究中，也发现了与以上研究基本一致的结果：与假手术组相比，模型组、miR-NC 组大鼠肾组织中NF-κB 信号转导通路中关键蛋白表达较高，而与miR-NC 组相比miR-216a 组大鼠肾组织中通路相关蛋白表达较低。此外，在脓毒症中，由于外来致病菌的感染，LPS 与TLRs 结合以后，经过信号通路的传导最终激活NF-kB 的转录，释放大量的促炎介质如TNF-α、IL-P、IL-1、IL-6、IL-10 等因子，导致炎症级联反应，最终影响疾病的预后。而本研究miR-216a 可以减少炎症因子释放，抑制NF-κB通路，这提示miR-216a 对脓毒症急性肾损伤的保护作用是通过抑制NF-κB 信号通路实现的。其抗炎机制可能是通过其抗炎机制可能是降低NF-κB p65 表达，抑制NF-κB 信号通路活化，降低炎性因子TNF-α，IL-6，IL-1β 分泌。

综上所述，过表达miR-216a 可能是通过调控NF-κB 信号通路，抑制脓毒症大鼠炎症因子的释放，阻断炎症因子的合成与释放，进而保护肾脏。miR-216a 可作为脓毒症急性肾损伤中的预测性生物标志物，对临床诊断及疗效判定等方面具有重要的意义。但是是否有其他miRNA 参与疾病进程尚不清楚，需要深入研究。