环状RNA circAAS1对人绒毛膜滋养细胞侵袭及迁移的影响

高丽娜 董燕 何晓春 张玉芳 刘小玲 郝曼 张莉 刘小晖

甘肃省妇幼保健院产二科（兰州 730050）

子痫前期（preeclampsia，PE）是一种妊娠期特有的进行性疾病，严重影响妊娠女性及胎儿的生长发育［1］，目前唯一有效的治疗方法是终止妊娠［2］，因此，研究子痫前期发生的潜在机制对进一步有效防治子痫前期具有重要意义。虽然子痫前期的确切发病机制尚不清楚［3］，但滋养细胞侵袭迁移不足引起胎盘发育缺陷是子痫前期发病的主要原因［4］。然而，滋养细胞侵袭迁移在子痫前期进展中的基本过程有待阐明。环状RNA（circRNA）是由共价闭合环路形成的一种新的非编码RNA［5］，参与细胞分化、生长、侵袭迁移等一系列细胞生理和病理活动［6］。研究表明，circRNA 在子痫前期母胎界面失调［7］，这些失调的circRNA 与子痫前期的发生发展有着复杂的相互作用［8］。最近，竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNAs，ceRNAs）假说提出，circRNA 可以通过microRNAs（miRNAs）反应元件（MREs）调控miRNA 水平，参与子痫前期的发生［9］。此外，miRNA在子痫前期中表达异常，是子痫前期的潜在防治靶点［10］。其中，miR-15a-5p参与许多癌症的发生发展，但在子痫前期中的研究鲜为少见。本课题前期研究发现circAAS1 在子痫前期中的差异表达，通过生物信息学软件发现与miR-15a-5p 的结合位点，但其生物学功能和潜在机制尚不清楚。本研究通过构建干扰和过表达circAAS1 滋养细胞系，探讨circAAS1 对滋养细胞功能行为影响，并分析其在子痫前期中的临床价值，为子痫前期的早期诊断及治疗提供更多的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究经甘肃省妇幼保健院伦理委员会审查批准（2022GSFY 伦审［21］号）。选取2020年5月至2021年5月在甘肃省妇幼保健院住院患者纳入研究。PE 组为子痫前期孕妇30 例，诊断标准参见《妇产科学（第九版）》教材；对照组（PC 组）为同期妊娠单胎孕妇30 例。排除标准：吸烟、多胎妊娠、慢性高血压、慢性肾炎、自身免疫性疾病、糖尿病、心脏病、血栓性疾病、HELLP 综合征、胎儿畸形等。所有参与者在甘肃省妇幼保健院签署知情同意书。两组孕妇年龄、孕周方面差异均无统计学意义（P＞0.05），收缩压、舒张压及尿蛋白差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组临床资料比较Tab.1 Comparison of clinical data between PC and PE groups ±s

表1 两组临床资料比较Tab.1 Comparison of clinical data between PC and PE groups ±s

年龄（岁）孕周（周）收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）尿蛋白（24 h/g）PC 组28.80±1.94 36.60±0.67 118.60±1.18 75.20±2.84 0.13±0.16 PE 组30.50±4.86 36.37±2.63 146.50±3.59 99.15±2.34 2.10±0.25 P 值0.123 3 0.975 1＜0.001＜0.001＜0.001

1.2 主要试剂 人绒毛膜滋养层细胞（HTR8/SVneo）购于上海盖宁公司；胎牛血清、RPMI-1640 培养基购自美国Gibco 公司；逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒购于日本Takara 公司；lip2000 购于美国Invitrogen 公司；青链霉素、胰蛋白酶消化液购于北京索莱宝公司；Matrigel 基质胶购自美国BD 公司；Transwell 小室购于美国Corning 公司；总RNA 提取试剂盒购于北京天根公司；circAAS1 和U6 引物由广州锐博生物科技公司合成，GAPDH 引物由上海生工公司合成，circAAS1 干扰片段及过表达质粒由上海吉玛公司构建。

1.3 细胞培养及转染 在适当的条件下（37 ℃、5% CO2）培养，取对数生长期的滋养细胞进行传代，按说明书添加助转试剂，将细胞分5 组：control组（空白组）、si-NC 组（干扰对照组）、si-circAAS1组（干扰circAAS1 组）、OE-NC 组（过表达对照组）和OE-circAAS1 组（过表达circAAS1 组）。

1.4 Transwell 实验 提前将在-20 ℃冰箱保存的Matrigel基质胶放4 ℃溶化，Transwell小室加Matrigel基质胶（避免气泡），放入37 ℃恒温培养箱凝固（迁移实验不用加）。用纯培养基重悬细胞并计数，按照2 × 104个细胞数加入上室，对应的下室加入800 μL 含15%血清培养基，孵育48 h 后，用4%多聚甲醛固定下室细胞，棉签将上室细胞擦去后，结晶紫染色10 min，用显微镜拍照。染色细胞使用Image-J 来计数细胞数量。

1.5 划痕实验 用6孔板培养细胞至70%～90%加入转染试剂，4 ～6 h换液后孵育48 h，用1 000 μL无菌枪头划痕，无血清培养基冲洗后用显微镜拍照，记录为0 h，孵育24 h后拍照记录为24 h，伤口愈合率计算公式：（初始面积-最终面积）/初始面积×100%。

1.6 Real-time PCR 检测 按照总RNA 提取试剂标准程序，从胎盘样本和滋养细胞中制备总RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit 逆转录合成cDNA，然后使用qRT-PCR 仪进行扩增。GAPDH，上游，5′-TGGCAGGTAGGCGGTTGTGTAGA-3′；下游，5′-ATGGCATCGTGCCTGGTCATAT-3′；U6 上游，5′-GCATATATAACCACGAGTTCAGGAAT-3′；下游，5′-CGCGGAGTTCACTCGCTAGTGCAT-3′；miR-15a-5p 上游，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-15a-5p，下游，5′-CGGCTAGCAGCACATAATGG-3′；circAAS1，上游，5′-AACCAAGCGCCTCCA-3′；下游，5′-TTGGAAGGCGGAGGT-3′。

1.7 统计学方法 使用Prism 7.0 统计软件分析实验数据，结果以均数±标准差表示。circAAS1与PE 临床指征的关系采用pearson 相关性分析，两组间均数采用独立样本t检验比较，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circAAS1 在子痫前期胎盘组织中的表达qRT-PCR 检测显示，与PC 组比较，PE 组胎盘样本中circAAS1 的表达水平显著升高（P＜0.01），提示circAAS1 调控异常可能与子痫前期有关，见图1。

图1 PC 组和PE 组胎盘中circAAS1 的表达水平Fig.1 Expression of circAAS1 in placenta of PC and PE

2.2 circAAS1 的表达水平与临床指征的相关 在PE 中，circAAS1 的表达水平与收缩压（r= 0.530，P= 0.002）、舒张压（r= 0.464，P=0.009）均有显著正相关，进一步提示circAAS1 的表达水平可能与子痫前期病情进展有关，可作为子痫前期的诊断标志物。见图2。

图2 PE 胎盘组织中circAAS1 的表达与临床指征的关系Fig.2 Relationship between expression of circAAS1 and clinical features in preeclampsia placenta tissues

2.3 circAAS1 干扰及过表达自身验证 检测过表达及干扰circAAS1 的效率，OE-circAAS1 组中circAAS1 表达高于OE-NC 组（P＜0.05），而si-circAAS1组中的circAAS1表达低于si-NC 组（P＜0.01），提示过表达circAAS1 及干扰circAAS1 细胞系构建成功。见图3。

图3 转染circAAS1 过表达质粒和干扰片段后circAAS1 的表达Fig.3 Expression of circAAS1 after transfection of circAAS1 overexpression and interference

2.4 circAAS1对滋养细胞侵袭能力影响 Transwell侵袭实验结果显示：与OE-NC 组比较，OE-circAAS1组穿过基质胶的细胞数明显减少（P＜0.01）；相反，与si-NC 组比较，si-circAAS1 组穿过基质胶细胞数增多（P＜0.05），提示circAAS1 过表达可阻止滋养层细胞的侵袭能力，而干扰circAAS1 后则相反。见图4。

图4 circAAS1 对滋养细胞侵袭影响Fig.4 Effects of circAAS1 on trophoblast invasion

2.5 circAAS1对滋养细胞迁移能力影响 Transwell迁移实验结果显示：与OE-NC组比较，OE-circAAS1组穿过膜的细胞数明显减少（P＜0.01）；相反，与si-NC 组比较，si-circAAS1 组穿过膜的细胞数增多（P＜0.05）；划痕实验结果显示：OE-circAAS1 组的滋养细胞横向迁移率明显降低（P＜0.05），提示过表达circAAS1 可引起滋养细胞纵向及横向迁移能力下降，而干扰circAAS1 后则相反。见图5。

图5 circAAS1 对滋养细胞迁移影响Fig.5 Effect of circAAS1 on trophoblast cells migration

2.6 circAAS1 在滋养细胞的定位及生物学软件预测miR-15a-5p是circAAS1可能作用的靶基因 通过滋养细胞定位分析，发现circAAS1 在滋养细胞中主要定位于胞质，提示circAAS1 在滋养细胞中可能在转录后发挥调控机制。通过StarBase 软件分析发现，miR-15a-5p 具有circAAS1 的结合位点，提示miR-15a-5p 可能是circAAS1 的下游靶基因，见图6。

图6 circAAS1 在滋养细胞中的定位及与miR-15a-5p 的预测结合位点Fig.6 Localization of circAAS1 in trophoblast cells and predicted binding site of circAAS1 and miR-15a-5p

2.7 miR-15a-5p 在PE 胎盘组织中的表达 qRTPCR 检测结果显示，PE 组miR-15a-5p 的表达水平显著低于PC 组（P＜0.01），提示circAAS1 可能对miR-15a-5p 有负向调节作用，见图7。

图7 miR-15a-5p 在PC 和PE 胎盘组织中的表达水平Fig.7 Expression of miR-15a-5p in placental tissues of PC and PE

2.8 circAAS1 对滋养细胞中miR-15a-5p 表达的影响 同时，qRT-PCR 结果显示，OE-circAAS1 组过表达circAAS1 后，miR-15a-5p 的表达水平明显降低（P＜0.01）；相反，干扰circAAS1 后则增加miR-15a-5p 的表达（P＜0.05），提示circAAS1 可能与miR-15a-5p 结合，见图8。

图8 circAAS1 对滋养细胞中miR-15a-5p 表达的影响Fig.8 Effect of circAAS1 on the expression of miR-15a-5p in trophoblast cells

3 讨论

子痫前期是一种胎盘疾病［11］，其主要由胎盘功能不全引起。由于病因及机制尚不清楚，明显降低了该病的防治率，目前只有少数有效的药物能控制子痫前期的进展［12］。因此，最近的研究一直致力于识别调控分子，如非编码RNA，许多研究已证实其参与子痫前期的发展及其调控分子机制［13］。希望通过深入研究能找到特异性分子可作为子痫前期的无创诊断、预后生物标记物及防治靶点。circRNA 是一类在物种间表现出高度稳定性和保守性的非编码RNA［14］，circRNA 与子痫前期的发展有关［15］，目前正在作为子痫前期治疗的潜在生物标志物和治疗靶点进行研究［16-18］。例如，GAI 等［19］发现hsa_circ_0007121 是一种早期子痫前期的潜在标志物，其在子痫前期胎盘中下调，并且通过影响上皮-间充质转化（EMT）正向调节滋养层细胞迁移。ZHOU 等［20］在子痫前期的胎盘和血浆样本中均显示circPAPPA 表达下调，circPAPPA的下调导致滋养层细胞的侵袭和增殖减少。然而，目前关于circAAS1 在子痫前期中的作用的研究尚未报道。因此，本研究主要是为了明确circAAS1 在子痫前期发展中的作用。本研究显示circAAS1 在子痫前期胎盘组织中高表达，并与子痫前期患者的收缩压及舒张压呈正相关，这表明circAAS1 可能是一个潜在的生物标志物。为了确定circAAS1 是否通过调节滋养细胞侵袭和迁移参与子痫前期，笔者将HTR8/SVneo 细胞作为基质细胞，通过Transwell 和划痕实验检测circAAS1 对滋养细胞侵袭迁移的影响，过表达circAAS1 可抑制滋养细胞的侵袭和迁移，然而，干扰circAAS1 后可增强滋养细胞的侵袭和迁移，提示circAAS1 可能参与了子痫前期的发生和发展，并随着子痫前期病情进展而表达增加，circAAS1 可能成为子痫前期早期诊断的标记物和防治靶点。

在人类疾病中，circRNAs 可以通过海绵吸附miRNA，调节亲本基因等发挥重要作用。在子痫前期中，circRNA 的生物学作用是通过介导miRNA/mRNA 轴来实现的［16］。例如，circ_0111277 作为ceRNA，靶向miR-424-5p/NFAT5 轴调控子痫前期滋养层细胞的迁移和侵袭［21］。hsa_circ_0026552上调通过miR-331-3p/TG-βR1 抑制子痫前期滋养细胞的增殖、迁移和侵袭［18］。本研究通过胞浆胞核定位实验发现，circAAS1 主要位于滋养细胞的胞浆中，故通过软件预测了circAAS1 的靶miRNA为miR-15a-5p，miR-15a-5p 已被证明是一种肿瘤抑制因子［22］，其通过抑制CXCL17 转录抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力［23］。LIU 等［24］研究miR-15a-5p 在胶质瘤进展中的作用，发现miR-15a-5p 可通过调节AEBP1 显著抑制胶质瘤细胞的恶性进展。以上研究均表明miR-15a-5p 对细胞表型有显著影响，包括抑制细胞增殖、迁移和侵袭等。因此，在子痫前期中，miR-15a-5p 可能促进滋养层细胞的再生，抑制子痫前期的发展。本研究结果发现miR-15a-5p 在子痫前期胎盘中低表达，结合上述的研究结果，提示miR-15a-5p 可能是抑制子痫前期发展的靶点，为了进一步证实circAAS1 在滋养细胞中对miR-15a-5p 表达的影响，本课题组构建了过表达和干扰circAAS1 细胞系，检测发现过表达circAAS1 可以明显下调滋养细胞中miR-15a-5p的表达，而抑制circAAS1 则增加miR-15a-5p 的表达，以上结果表明circAAS1 可以与miR-15a-5p 相互作用来调节滋养细胞功能行为。

综上所述，本研究发现circAAS1 直接靶向miR-15a-5p 抑制滋养层细胞的侵袭和迁移能力，其可能是子痫前期诊断和治疗的有效靶点。然而，本研究也存在一些局限性。首先，miR-15a-5p 的下游靶基因尚不清楚；其次，临床样本较少。因此，本课题组将继续增加临床样本量，探究miR-15a-5p 的下游靶基因，更进一步明确circAAS1 在子痫前期进展中的分子机制，将为进一步探索circRNA在子痫前期研究领域奠定良好的基础。