IP3 R与RyR对新生大鼠心肌细胞钙振荡调控的研究

戚 瑛 ,赵芯仪 ,姚佳辉 ,谢文俊 ,张伊

(1.西安交通大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系,陕西西安 710061;2.西安交通大学生命科学与技术学院,陕西西安 710049)

在心肌细胞内,由动作电位或其他原因引起的细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)周期性起伏波动,以一定的节律在细胞质中进行信息传递,称为钙振荡[1-2],它是维持心肌细胞兴奋功能的关键因素。结合目前众多研究者对成年大鼠心肌细胞内钙振荡的研究,推测钙振荡的产生可能与肌浆网上的两种通道蛋白——1,4,5-三磷酸肌醇受体(1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)和雷诺丁受体(ryanodine receptor,Ry R)密切相关[3-7]。它们通过调节肌浆网的钙释放来调节细胞内局部钙离子浓度,影响钙信号传导,从而调节心肌细胞的生理状态。但相比成年大鼠心肌细胞钙振荡研究工作的普遍与深入,对新生大鼠心肌细胞钙振荡的研究工作相对较少[8-9]。基于成年与新生哺乳动物心肌细胞结构的差异,在未完全发育的新生大鼠心肌细胞内,IP3Rs与Ry Rs通道对钙振荡信号的调控作用及影响机制目前仍不清楚。

本研究以原代分离、体外培养的新生大鼠心肌细胞模型为基础,使用IP3Rs与RyRs通道的激动剂phenylephrine、caffeine及阻断剂2-APB、tetracaine改变通道活性,通过钙离子荧光探针fura-2 在荧光显微镜上实时成像观察心肌细胞内钙振荡的发生频率及幅度,研究IP3Rs与RyRs通道对细胞质钙振荡信号的影响;同时记录phenylephrine对不同培养时期新生大鼠心肌细胞内钙瞬变信号的影响,探究哺乳动物心脏发育过程中IP3R通道对钙振荡的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

出生后24 h 内的清洁级SD(Sprague-Dawley)大鼠,雌雄不限,由西安交通大学实验动物中心提供。

1.2 主要药物与试剂

高糖DMEM(dulbecco’s minimum essential medium)培养基(GIBCO),新生牛血清(杭州四季青公司),10 000 U/m L 青链霉素混合液(Solarbio),Ⅱ型胶原酶(GIBCO),5-溴-2-脱氧核苷(Sigma),Fura-2/AM(AAT),caffeine(RyRs激动剂,Sigma),2-APB(IP3Rs抑制剂,Sigma),tetracaine(Ry Rs 抑制剂,Sigma),phenylephrine(PE,IP3Rs激动剂,Santa),Pluronic f127(AAT)。

1.3 新生SD大鼠心肌细胞的分离、纯化、培养及实验分组

无菌条件下剖胸取出新生大鼠心脏,用含双抗的磷酸缓冲液冲洗去残血,剪成1 mm3大小的组织块,用0.2%胶原酶在37℃水浴下梯度消化(每5 min收集一次细胞),直至组织团块消失。收集消化液1 000 r/min离心5 min,将所得细胞置于含200 mL/L胎牛血清的DMEM 培养液中,在37℃、50 mL/L CO2培养箱内培养1 h,采用差速贴壁法去掉成纤维细胞。在新的培养皿中加入洁净无菌的盖玻片(0.17 mm 厚度,用于在荧光显微镜上进行钙成像),将差速贴壁后的细胞悬液滴到盖玻片上,静置2 h使细胞贴壁并爬片,然后向培养皿中加入适量培养液,并加入5-溴-2-脱氧核苷(5-Brd U)以抑制非心肌细胞的生长,继续培养至指定的时间用于钙成像实验。

为研究IP3Rs和RyRs对新生大鼠心肌细胞钙振荡的影响,细胞在培养3 d后,利用不同药物刺激并分别与对照组(Control)进行比较(包括Controlvs.PE、Controlvs.2-APB、Controlvs.Caffeine、Controlvs.Tetracaine)。为探究IP3Rs对不同培养时间新生大鼠心肌细胞内钙振荡的影响,细胞分别培养3 d、7 d、10 d后,检测PE刺激引起的胞内钙振荡频率的变化(3 dvs.7 dvs.10 d)。

1.4 心肌细胞内钙离子浓度的测量

本研究使用奥林巴斯荧光倒置显微镜CKX53来实时监测细胞钙信号,成像物镜为20×,0.75 NA的空气镜,光源为功率300 W 的氙灯,能通过光栅发出稳定的单色光,荧光信号由EM-CCD 采集。成像实验的环境温度通过空调系统维持在25℃左右,成像台式液(Tyrode solution)预先放置在该环境下,使温度与环境一致。

向待测量的细胞中加入终浓度为4μmol/L Fura-2/AM 与0.1%Pluronic F127,37℃避光条件下孵育30 min,而后用成像液冲洗3遍,将铺种细胞的盖玻片固定在成像皿并放置在显微镜载物台上,选取一个细胞数量较多且铺展成片的视野,用波长340 nm 和380 nm 紫外光交替激发,采集510～530 nm 波段荧光信号成像,图像采集频率为10 帧/s,采集时间持续2 min。

图像用Simple PCI软件进行分析处理。同一盘(即一片盖玻片)的细胞钙振荡频率一致,取其中所有细胞的幅度均值和该频率值,作为这盘细胞的幅度和频率。

1.5 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示。每个数据点代表一盘细胞,每组包含9～12盘细胞,来自至少3批独立的原代细胞分离。用GraphPad Prism 7.0软件对数据进行统计分析。多组均数比较采用单因素方差分析及Bonferroni多重比较检验,两组间比较采用非配对t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 新生大鼠心肌细胞模型的建立

利用细胞计数控制每盘的细胞接种数量在2×105/m L。视野中未贴壁的心肌细胞数量大量减少,背景干净,贴壁的心肌细胞密度适中,伸出伪足相互接触而聚集成同步搏动的心肌细胞单层,活力状态良好(图1)。

2.2 IP3 R 通道抑制剂2-APB 与激动剂Phenylephrine作用后,心肌细胞钙振荡信号的测量结果

培养3 d的心肌细胞在荧光倒置显微镜下进行实时钙成像。图2展示了对照组(control)和IP3R 通道抑制剂10μmol/L 2-APB 处理组的钙振荡特征。图2A 为各组同一视野的3个典型细胞的钙振荡曲线,这些细胞保持了同步钙振荡。经过对钙信号处理和统计分析后,如图2B 所示,与Control组相比,经2-APB作用后,细胞钙振荡信号频率下降(P＜0.05),但幅度并没有明显变化。图3 展示了control组和IP3R通道激动剂10μmol/L PE 处理组的钙振荡特征。图3A 为各组同一视野的3个典型细胞的钙振荡曲线,这些细胞保持较好的同步性,跳动频率一致。应用10μmol/L PE作用后,细胞的钙振荡信号频率上升(P＜0.001),而钙振荡幅度虽有上升趋势,但无统计学差异(图3B)。

图3 IP3 R 通道激动剂PE对新生大鼠心肌细胞钙振荡的影响Fig.3 Effect of IP3 Rs agonist PE on Ca2+oscillations in NRCMs

2.3 RyR 通道抑制剂tetracaine与激动剂caffeine作用后心肌细胞钙振荡信号的测量结果

培养3 d的心肌细胞,经100μmol/L tetracaine作用后,细胞原本节律性的钙振荡完全被抑制,没有信号(图4A、4B);经500μmol/L caffeine作用后,细胞的钙振荡信号频率有所上升,但同一视野中不同细胞的钙振荡信号同步性被打乱,钙信号频率不再保持一致(图4C、4D)。

图4 RyR 通道活性改变对新生大鼠心肌细胞钙振荡信号的影响Fig.4 Effects of altered RyRs activities on Ca2+oscillations in NRCMs

2.4 IP3R 通道对钙信号的调控作用随时间变化情况的统计结果

用IP3R的激动剂PE分别对培养3 d、7 d及10 d的细胞进行处理,并分别统计其频率变化的倍数。作为IP3R 的激动剂,PE 能够增强IP3R 的活力,增加钙振荡的频率,但被激动后的心肌细胞钙振荡的频率上升倍数随培养时间的增加而呈下降趋势,并且培养7 d及10 d的细胞钙振荡频率变化倍数与3 d的相比,其下降具有统计学意义(图5)。

图5 PE对不同培养时间的心肌细胞钙振荡信号频率的影响Fig.5 Effect of PE stimulation on NRCMs cultured for different time

3 讨 论

钙离子作为细胞内的第二信使,调节着许多生物学功能。心肌细胞内的钙离子以反复瞬变的方式在细胞质中的节律性传递称为钙振荡,是心脏维持收缩-舒张功能的关键性过程[2,10]。相比于对成年哺乳动物心肌细胞内钙信号研究的普遍与深入,对新生及发育期心肌细胞中钙振荡的相关研究工作还较为欠缺,其具体的调节机制仍是本领域尚待探讨的问题之一[11-12]。

心肌细胞内钙离子主要来自于肌浆网的钙释放,IP3Rs与Ry Rs作为心肌细胞内肌浆网上的两种主要的钙离子释放通道,对钙信号的调控方式却并不完全相同[13]。在成年的心肌细胞中,IP3Rs通道所占比例降低[7,14],因此其对钙信号的调控作用将下降,在新生期的心肌细胞中,IP3Rs通道占比较大,IP3Rs与Ry Rs如何协调肌浆网的钙释放一直是未解的问题之一[7,11]。本研究发现,对培养3 d的新生大鼠心肌细胞,加入IP3Rs通道的抑制剂2-APB 或者激动剂PE,心肌细胞内钙振荡的幅度并无明显变化,而加入Ry Rs通道的抑制剂tetracaine能够将细胞的钙振荡信号完全抑制。这些结果表明,在新生期的心肌细胞中,尽管IP3Rs的占比远高于成年期,但Ry Rs通道仍是肌浆网钙离子释放的主要通道。

心脏的节律性舒缩由构成心脏的全体心肌细胞的协调一致的钙振荡和随之而来的搏动所控制[2]。成年心脏中,由窦房结发放冲动传导到不同部位的心肌细胞,使细胞膜去极化,膜上内陷的横管系统上分布的L-型钙离子通道开放,少量外钙内流,与Ry Rs结合,从而激活该通道,使肌浆网内的钙离子大量释放,这就是经典的“钙致钙释放机制”[2,10]。而在新生期的心肌细胞中,缺乏横管系统,因此需要另外的机制来协调心肌细胞的钙振荡节律[11-12,14]。本研究发现,体外培养的心肌细胞单层有自发的同步化的钙振荡,抑制或者激动IP3Rs能相应地降低或增加心肌细胞钙振荡的频率,而加入RyRs通道的激动剂caffeine,虽能提高单个细胞钙振荡频率,却打乱了细胞搏动的同步化。这些结果说明,IP3Rs在维持新生大鼠心脏搏动的节律方面起主要作用。当细胞受到刺激时,肌浆网上的IP3Rs首先被激活并释放少量Ca2+,这些Ca2+进一步激活邻近的Ry Rs通道,使肌浆网钙库内的钙离子大量释放,引起细胞内钙离子浓度上升。而PE对不同培养时间的细胞钙振荡信号的影响结果表明,随着培养时间的增加,IP3Rs通道的激动剂PE对钙振荡的激动效果逐渐下降,这说明随着心脏的发育,心肌细胞内的IP3Rs比例下降,对钙振荡的调控作用下降。心肌细胞钙振荡受到许多因素调控,舒张期钙离子通过细胞膜外排和肌浆网的钙回收是影响钙振荡频率的重要因素。有研究表明,PE和caffeine除了作为钙离子通道的激动剂,对细胞膜上的钠钙交换器(Na+-Ca2+exchanger,NCX)及肌浆网钙泵(SERCA)也有调控作用[15]。因此,需要新的研究进一步阐明这些因素对钙振荡的调控作用。

自20世纪60年代开始,国内外许多学者对心肌细胞的原代培养方法展开了广泛研究[16]。目前,新生大鼠心肌细胞已成为常用的体外细胞实验模型。新生大鼠的出生时间越短,心肌细胞分离后越容易贴壁,成活率也越高,因此本研究选用出生24 h 内的SD(Sprague-Dawley)大鼠作为实验对象。在新生大鼠心肌细胞培养过程中,有两个必须关注的主要问题:一是分离细胞过程中酶的活力和消化时间会明显影响心肌细胞的数量和活力状态。消化力度过大,分离下来的细胞损伤严重甚至死亡;消化不足,则会导致分离的心肌细胞数量少,密度小,无法连成片而跳动。本研究采用0.2%胶原酶梯度消化法,消化时间持续30 min,期间每5 min摇震1次并收集上清细胞。二是快速增殖的非心肌细胞会对心肌细胞的生长造成影响,过度生长的非心肌细胞会抑制心肌细胞的生长。本研究在前人差速贴壁法去除非心肌细胞的基础上[17-18],加入5-Brd U 来抑制非心肌细胞的增殖,同时保持心肌细胞生长状态的稳定,保证长时间培养后心肌细胞仍可保持较高纯度,不会对研究结果造成明显影响。

但目前针对幼鼠心肌细胞内钙信号的发生与调节过程以及发育期心脏的钙调控变化依然存在很多亟待解决的问题[11,14]。可以尝试利用siRNA 或转基因动物对IP3R 与RyR 分别进行特异性的敲除,从而研究单个通道对钙振荡的调控作用。除此之外,在二维培养心肌细胞的基础上,可尝试在胶原支架上接种心肌细胞,让种植的心肌细胞在三维支架上生长分化成为具有收缩功能的心肌组织块,为体外研究心脏的结构功能提供仿真实验模型,同时也为利用组织工程手段培养出有功能的体外心肌组织替代物创造条件。

综上,本研究揭示了新生期的心肌细胞中,IP3Rs在维持新生大鼠心脏搏动的节律方面发挥主要作用,而Ry Rs则承担释放内钙的主要任务,IP3Rs通过激活Ry R 通道来实现对钙信号的调控;随着心脏的发育,心肌细胞内的IP3Rs比例下降,对钙振荡的调控作用下降。