FTO 减少DKK2的m6 A修饰和促进DKK2表达而减少心肌纤维化

李 溪 ,王坤荣

(1.宁夏医科大学总医院心血管内科,宁夏银川 750004;2.山东医专附属费县人民医院,山东临沂 273400)

在各种心血管疾病中,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是造成死亡及残疾的最主要原因之一[1]。心肌梗死后主要的病理过程是心肌纤维化,而有效抑制心肌纤维化能改善预后,提高患者生存率[2]。但目前对于心肌纤维化的具体机制还不甚清楚。已发现N6甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)具有多种生物学功能,是目前研究的热点[3]。m6A 是一种RNA 修饰方式,在真核细胞中极其丰富,能调控RNA 的定位、输出、剪切、稳定和翻译等,进而与多种人类疾病的进展密切相关[4]。近年来有研究发现,m6A 同样影响冠心病、AMI和心力衰竭等多种心血管疾病的进展[5]。其中脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)是m6A 去甲基化酶的最主要成员,能减低m6A 修饰水平[6]。MATHIYALAGAN 等[7]研究发现,FTO 在心力衰竭哺乳动物心脏和缺氧心肌细胞中的表达下调,其可对心肌收缩相关基因选择性地去甲基化,减少缺血诱导的m6A 增加,从而降低降解而改善在缺血条件下的蛋白表达水平,最终改善心脏收缩功能。这提示FTO 调控的m6A 甲基化修饰在心力衰竭进展过程中发挥关键作用。虽然目前已有研究报道FTO 与多种心脏疾病相关[8],但对于其具体作用机制还研究不多。

Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长、分化、迁移、黏附的重要途径,已被证实在心室重构中发挥重要作用,而dickkopf 2(DKK2)是此通路的主要拮抗剂,具有抑制多种纤维化进程的作用[9-11]。有研究显示,DKK2能抑制α-平滑肌肌动蛋白和Ⅱ型胶原等促纤维化基因的表达,进而抑制肝星状细胞的活化而减少肝纤维化[10]。本课题组前期研究也发现,DKK2在心肌纤维化过程中具有重要作用[11],且序列分析表明,DKK2含有m6A 修饰位点。因此,FTO 在心肌纤维化过程中发挥作用是否与DKK2相关值得深入研究。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

人心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)和成纤维细胞生长补充剂-2(ScienCell研究实验室);C57BL/6 小鼠(宁夏医科大学实验动物中心);DMEM 培养基、胎牛血清、双抗、Lipofectamine 3000转染试剂、TRIzol Plus RNA 纯化试剂盒和DKK2一抗(Thermo Fisher Scientific公司);血管紧张素Ⅱ(AngⅡ,Sigma公司);过表达载体和All-in-One第一链cDNA 合成试剂盒(GeneCopoeia公司);siRNA和引物(上海吉玛公司);TB Green Fast qPCR Mix(TaKaRa公司);Magna RIP RNA 结合蛋白免疫沉淀试剂盒(Millipore公司);CCK-8试剂盒、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒和RIPA裂解液(上海碧云天公司);FTO一抗和二抗(Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 细胞培养及急性心肌梗死小鼠模型构建及心功能评价

原代人CFs用DMEM 培养基培养,加入1 mL/L成纤维细胞生长补充剂-2、100 mL/L 胎牛血 清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素。用100 nmol/L AngⅡ刺激CFs 48 h诱导纤维化表型。

将C57BL/6小鼠于特定无病原体环境中饲养。用7-0外科缝线永久结扎左冠状动脉前降支,构建AMI模型,然后将含有FTO 过表达质粒的纳米粒以200μL体积腹腔注射于AMI小鼠体内。在AMI后14 d进行超声心动图测定心脏功能,测量左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)并通过超声心动图软件自动计算。小鼠麻醉后,用二氧化碳进行窒息安乐死,摘取心脏组织测量各组小鼠的心脏质量(HW)和体质量(BW),并计算其比值;留取心脏组织进行相关实验检测。本研究经宁夏医科大学动物研究所伦理委员会批准;本实验根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。

1.3 细胞转染和实时定量PCR(RT-qPCR)检测

使用Lipofectamine 3000 转染试剂将空载体(EV)和FTO 过表达载体(FTO-O)分别转染CFs,或共转染FTO-O 和DKK2 siRNA(5'-GGGCCAAACTCAACTCCAT-3'),然后将各组CFs 与100 nmol/L AngⅡ孵育48 h。使用TRIzol Plus RNA 纯化试剂盒从小鼠心脏样本或培养的CFs中提取总RNA,接着使用All-in-One第一链cDNA 合成试剂盒合成cDNA。使用TB Green Fast qPCR Mix进行RT-qPCR 检测FTO、DKK2、α-SMA、collagen Ⅰ和collagenⅢ的m RNA 表达。所用引物序列见表1。

表1 RT-qPCR 各基因引物序列Tab.1 Gene sequence of primers for RT-qPCR

1.4 DKK2的m6 A修饰水平的检测

使用Magna RIP RNA 结合蛋白免疫沉淀试剂盒进行RIP分析。将3×107个CFs用150μL RIP裂解缓冲液裂解,然后在4℃下与包被有m6A 抗体的磁珠孵育过夜。纯化共沉淀RNA后,用RTqPCR 通过扩增m6A 共有序列区域,检测m6A+DKK2 mRNA 水平。

1.5 细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞存活力

将CFs接种到96孔板,转染按“1.3项”步骤进行,然后用AngⅡ刺激,将10μL CCK-8溶液加至各组CFs中,37℃下培养2 h。通过酶标仪测量450 nm处的吸光度值。

1.6 组织病理学观察和免疫组织化学染色

将所取心肌组织进行苏木精-伊红(HE)染色以评估形态学变化。进行Masson染色以确定梗死面积和胶原纤维程度。梗死区面积按以下公式计算:梗死百分比=(左心室梗死内径长度+左心室梗死外径长度)/(左心室梗死内径周长+左心室梗死外径周长)×100%。使用Image J软件测量心肌纤维化面积,然后计算胶原体积分数=纤维化面积/左心室总面积×100%。

1.7 Western blotting检测蛋白表达

用预冷RIPA 裂解各组CFs获得含总蛋白的细胞裂解物,40μg蛋白上样进行电泳,转膜后分别加入DKK2(1∶800)或FTO(1∶600)一抗于4℃孵育过夜后,加入辣根过氧化物酶(HRP)结合的二抗(1∶5 000),室温下孵育1 h。最后用化学发光底物(ECL)显影,拍照定量分析蛋白条带的灰度,评估蛋白的相对表达水平。

1.8 统计学分析

所有实验至少重复3次。数据的统计分析采用SPSS 20.0软件,计量资料以均数±标准差表示,在满足正态性及方差齐性的条件下,组间比较采用方差分析,多重比较采用LSD-t检验;不满足参数检验条件时,组间比较采用Kruskal-Wallis检验。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FTO 调控DKK2 的m6 A 修饰与CFs活化的关系

用AngⅡ诱导CFs活化发现,AngⅡ显著抑制FTO和DKK2的表达,过表达FTO 显著逆转AngⅡ抑制DKK2表达的作用;同时检测DKK2的m6A 水平发现,AngⅡ增加DKK2 的m6A 修饰,而过表达FTO 阻断AngⅡ增强m6A 修饰的作用;细胞存活力检测结果显示,AngⅡ促进CFs的存活,而过表达FTO 抑制AngⅡ的促存活作用;另外,AngⅡ促进α-SMA、collagen Ⅰ和collagenⅢ的表达,过表达FTO也同样显著减少AngⅡ的促表达作用;但当共转染FTO 过表达载体和DKK2 siRNA时,DKK2 siRNA可拮抗FTO 过表达作用,从而恢复AngⅡ促进CFs的存活和上调α-SMA、collagen Ⅰ和collagenⅢ表达的作用(图1)。

图1 AngⅡ活化心肌成纤维细胞的作用与FTO、DKK2的关系Fig.1 The relationship b etween AngⅡ-induced activation of cardiac fibroblasts and the expressions of FTO and DKK2

2.2 FTO 对AMI小鼠心功能的影响

构建AMI小鼠模型后,评估FTO 对心功能的影响作用,结果显示,AMI 小鼠的LVEDD 和LVESD 较正常对照组小鼠显著增加(P＜0.05),而LVEF和LVFS明显减少(P＜0.05);AMI小鼠的心脏质量/体质量的比率(HW/BW)也较正常对照组小鼠显著增加(P＜0.05);在上调FTO 的表达后,AMI小鼠的LVEDD、LVESD和HW/BW 较AMI组显著减少(P＜0.05),而LVEF 和LVFS 明显增加(P＜0.05,图2)。

图2 FTO 与AMI小鼠心功能的关系Fig.2 The relationship between FTO and cardiac function in AMI mice

2.3 FTO 与AMI小鼠病理进展的关系

HE 染色显示,AMI小鼠心脏有明显的成纤维细胞增殖、心肌肥厚和更多的纤维化;当FTO 过表达时,上述AMI的典型生理现象显著被改善(纤维化减少),梗死面积减小;同时,Masson 染色也显示,AMI小鼠左心室前壁梗死区的心肌组织被胶原纤维替代,胶原纤维显著增加;而FTO 过表达可显著减少上述现象(图3)。

图3 FTO 与AMI小鼠病理进展的关系Fig.3 The relationship between FTO and pathological progression in AMI mice

2.4 FTO 与AMI小鼠DKK2的m6 A 修饰、表达的关系

检测FTO 和DKK2的表达发现,FTO 和DKK2在AMI小鼠中的表达均显著减少;过表达FTO时,DKK2在AMI小鼠中的表达也显著上升;检测FTO和DKK2的蛋白水平也有类似的发现,FTO 过表达能显著恢复DKK2在AMI小鼠中的表达;同时检测DKK2 的m6A 水平发现,DKK2 的m6A 修饰在AMI小鼠中显著增加,而过表达FTO 显著减少DKK2的m6A 水平(图4)。

图4 FTO 调控AMI小鼠中DKK2的m6 A修饰和表达水平Fig.4 FTO regulated m6 A modification and expression level of DKK2 in AMI mice

3 讨 论

心肌纤维化是AMI后的重要病理变化。近年来有研究表明,m6A 也与心血管疾病等多种疾病密切相关[12]。但到目前为止,关于m6A 在心血管进展中作用机制的相关研究很少。

FTO 是一种关键的m6A 去甲基化酶,在多种人体组织中广泛表达。近年来,有研究发现,FTO 在多种心血管疾病中表达异常,可能具有重要的调控作用[13]。例如,MATHIYALAGAN 等[7]研究发现,FTO 在心肌梗死小鼠模型中过表达能降低纤维化并增强血管生成。FTO 在缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞中表达下调,其表达上调能下调SERCA2a基因的m6A 水平,从而增加心肌细胞活力、线粒体膜电位和ATP含量,并减少细胞毒性、细胞凋亡、ROS含量和钙浓度,因此认为FTO 通过去甲基化降低SERCA2a m RNA 的m6A 水平,从而促进SERCA2a表达,维持钙稳态,改善H/R 心肌细胞的能量代谢[14]。本研究进一步的探讨也表明,AngⅡ诱导心肌成纤维细胞活化的过程中,FTO 表达下调;同时,FTO 在AMI 小鼠中的表达也显著下调;过表达FTO 显著抑制CFs的存活力,改善心肌功能和减少AMI小鼠的纤维化水平,这表明FTO 确实在心脏的正常功能发挥中具有关键的调控作用。针对糖尿病心肌病(DCM)小鼠的研究也发现,m6A 总水平在DCM 中升高,且相关的基因与心肌纤维化、心肌肥厚和心肌能量代谢密切相关;其中FTO 表达下调,过表达FTO 可通过减少心肌纤维化和心肌细胞肥大而改善心功能[15]。因此,FTO 在心肌疾病中意义非凡,可能是诊断治疗的一个重要靶点。

研究进一步表明,在AngⅡ活化的CFs和AMI小鼠中,DKK2 的m6A 水平增加,而其表达水平下调;FTO 能减少DKK2 的m6A 水平,从而增强DKK2的表达。DORN 等[16]检测心肌细胞m RNA的m6A 甲基化水平发现,肥大刺激会导致一系列基因的m6A 水平增加,表明m6A 甲基化可能在心肌细胞肥大中发挥作用。SUN 等[11]研究发现,转染DKK2 siRNA 可导致β-catenin、α-SMA、胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的水平升高,同时增强CF 的增殖和迁移,并减少凋亡。Sept4 在肝星状细胞中缺失会导致DKK2表达减少而激活经典的Wnt通路,进而促进促纤维化基因的表达和抑制抗纤维化基因Smad7的表达,从而导致肝星状细胞发生促纤维化转化[10]。HONG等[17]发现,长期暴露于纳米TiO2所导致的肾纤维化与DKK2 的表达下调密切相关。上述研究表明,DKK2在多种纤维化过程中发挥作用。FTO 在心力衰竭小鼠中的表达下调,其过表达导致H/R 处理的心肌细胞中Mhrt的上调和Mhrt的m6A 修饰减少,从而降低H/R 处理的心肌细胞凋亡[18]。因此,FTO可通过调控DKK2等关键基因的m6A 修饰水平而上调相对应基因的表达水平,从而在心肌疾病中发挥作用。

综上,FTO 可通过减少DKK2的m6A 修饰水平而促进DKK2的表达,进而抑制心肌纤维化的进展,表明FTO/DKK2通路是调控心肌纤维化的关键通路,可成为诊断治疗心肌纤维化相关疾病的重要靶点。