基于脂肪源性干细胞的alphastatin肽胶质瘤靶向载体的构建及其对血管生成的抑制作用

朱 强 ,张斌斌 ,李瑞春 ,郭世文 ,梁晨

(1.西安交通大学第一附属医院神经外科,陕西西安 710061;2.延安大学附属医院神经外科,陕西延安 716000)

胶质瘤是一类严重危害人类生命健康的颅脑肿瘤,在接受手术+放疗+辅助化疗的标准治疗方案后,患者的预后仍不尽如人意[1]。血管生成在胶质瘤的发生及进展中扮演了十分重要的角色[2],因此抗血管生成治疗被认为是一种十分有前景的治疗策略[3]。alphastatin肽是一种由24个氨基酸构成的短肽,其来源于人纤维蛋白原α链氨基末端[4]。本课题组前期研究发现,alphastatin肽能够在体外抑制内皮细胞管腔形成,并在动物模型中抑制胶质瘤血管生成进而抑制肿瘤生长[5]。脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是一种来源于脂肪组织、具有间充质及神经谱系分化潜质的干细胞,由于其对恶性肿瘤的靶向性,因而被认为是肿瘤基因治疗的良好载体[6]。本研究拟在前期研究基础上构建基于ADSCs的alphastatin肽胶质瘤靶向载体,并对其生物学特性进行初步评估。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养

U87胶质瘤细胞、SHG44 胶质瘤细胞、293T 细胞、HLF-1人成纤维细胞以及HUVEC人脐静脉内皮细胞购于武汉Procell公司,ADSCs购于苏州Cyagen公司。U87、SHG44及293T细胞使用含100 mL/L胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,Gibco)的DMEM 培养基(Gibco)培养,HLF-1 及HUVEC 细胞使用含100 mL/L FBS的F12K 培养基(Procell)培养。ADSCs使用人脂肪源性干细胞专用培养基(Cyagen)培养。所有细胞均在50 mL/L CO237℃恒温培养箱中培养。

1.2 基于ADSCs的alphastatin肽胶质瘤靶向载体的构建

慢病毒载体质粒p LVX-mCMV-ZsGreen-IRESPuro购于Viraltherapy公司,由于单独的alphastatin序列无法在哺乳动物细胞中有效表达和分泌,因此需要将人神经营养蛋白-4(human neurotrophin-4,NT-4)信号肽序列和前导序列与alphastatin 肽序列融合(NT4-Al),从而实现alphastatin 肽的分泌表达[7]。由于alphastatin肽暂无可供检测的抗体,因此在其序列末端加上FLAG 标记序列便于检测。包含NT4信号肽序列-alphastatin 肽序列-FLAG 标记序列(NT4-Al-FLAG)融合基因片段的p UC57-NT4-alphastatin质粒由Genscript公司设计并合成。NT4-Al-FLAG 序列被克隆进p LVX-mCMV-ZsGreen-IRES-Puro中并经过酶切分析及测序鉴定。使用慢病毒包装试剂盒(Viraltherapy)通过转染293T 细胞构建alphastatin慢病毒表达载体。转染48h后收集含慢病毒的上清液。随后用alphastatin慢病毒感染ADSCs细胞,获得能够表达alphastatin肽的胶质瘤靶向载体(Al-ADSCs)(MOI=20)。

1.3 检测转染后ADSCs的干细胞表面标志物

利用流式细胞仪检测干细胞表面标志物评估慢病毒转染是否影响ADSCs的生物学特征。基于ADSC的alphastatin肽胶质瘤靶向载体(Al-ADSCs)及普通ADSCs以5×105/孔接种于6孔板中常规培养48 h。随后收集细胞并用0.1 mL 含有5 mL/L 牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的磷酸缓冲盐(phosphate buffer saline,PBS)重悬。分别加入APC标记抗人CD13抗体(biolegend)、APC标记抗小鼠/人CD44抗体(biolegend)、PE/Cyanine7 标记抗人CD90(Thy1)抗体(biolegend)及PE标记抗人CD105(Endoglin)抗体(eBioscience),4℃孵育30 min。细胞用含5 mL/L BSA 的PBS冲洗2次后,加入0.2 mL PBS制备单细胞悬液并上机检测。

1.4 Western blotting检测基于ADSC的alphastatin肽胶质瘤靶向载体(Al-ADSCs)中alphastatin肽的表达

由于alphastatin肽暂无可供检测的抗体,因此alphastatin肽的表达通过检测FLAG 标签的表达水平间接实现。总蛋白的提取及Western blotting检测方法同参考文献[8]所述。一抗:山羊抗FLAG 标签抗 体(1∶1 000;abcam)、兔 抗GAPDH抗体(1∶5 000;Bioworld);二抗:HRP 标记山羊抗兔IgG抗体(1∶5 000;博士德)、HRP 标记兔抗山羊IgG 抗体(1∶5 000;博士德)。

1.5 Al-ADSCs分泌alphastatin肽的测定

通过FLAG 标记蛋白ELISA 试剂盒(biovision)进行检测。转染后48 h,取各组ADSCs 培养液,3 000 r/min离心20 min,取离心后上清液按照试剂盒说明书进行检测。

1.6 CD133+胶质瘤干细胞(GSCs)流式细胞仪分选

收集常规培养的U87及SHG44细胞并用1 mL含5 mL/L BSA 的PBS重悬并加入EP 管中,每管1×106个细胞。4℃下1 500 r/min离心3 min,用含5 mL/L BSA 的PBS冲洗1次,随后加入CD133抗体(Invitrogen)4℃孵育30 min。细胞用含5 mL/L BSA 的PBS冲洗2次并重悬后运用流式细胞仪进行分选。

1.7 GSCs体外趋向性的评估

采用细胞迁移实验进行分析。将CD133+GSCs、CD133-胶质瘤细胞或HLF-1细胞接种在24孔板中,常规培养过夜,然后将Al-ADSCs及普通ADSCs(3×105/m L)接种于带有8μm 微孔PET膜的Transwell小室(BD Bioscience)中,放置在24孔板中与下室细胞常规共培养过夜。随后Transwell 小室在4℃下用700 mL/L乙醇溶液固定1 h,并用5 g/L结晶紫染色。擦去位于小室内未迁移的细胞,在光学显微镜(IX51,Olympus)下对迁移细胞进行计数(×200)。

1.8 体外血管生成的评估

Al-ADSCs对内皮细胞血管生成的影响通过体外管腔形成实验进行评估。将Matrigel基质胶(Corning)于4℃静置24 h,随后以0.1 mL/孔铺于24孔板中,-20℃预冷10 min,随后于37℃孵育30 min。HUVECs(1.5×105/孔)接种于Matrigel基质胶上,37℃常规培养2.5 h。将Al-ADSCs及ADSCs细胞悬液(3×105/mL)分别接种于薄膜孔径0.4μm的Transwell小室(BD)中(200μL/孔),随后将Transwell小室放入接种了HUVECs的24 孔板中共培养,37℃常规孵育8 h。在光学显微镜(IX51;Olympus)下对内皮细胞形成的管腔进行观察及计数(×100),具体方法同参考文献[9]。

1.9 统计学分析

应用SPSS 25.0统计软件进行统计分析。计量资料以xˉ±s表示。采用单因素方差分析检验Al-ADSCs、ADSCs对GSCs的迁移细胞数量以及各组HUVECs体外血管形成数量等指标是否存在差异,进一步组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基于ADSC的alphastatin肽胶质瘤靶向载体特征鉴定

如图1中所示,在Al-ADSCs中可检测到FLAG标记蛋白表达(图1A),这表明Al-ADSCs能够表达alphastatin肽,而普通ADSCs无alphastatin肽表达。此外,在Al-ADSCs培养基上清液中可检测到FLAG标记,质量浓度为(54.65±5.63)mg/L(图1B),表明Al-ADSCs具有分泌alphastatin肽的功能。与ADSCs相比,Al-ADSCs中的间充质干细胞(MSC)表面标志物如CD13、CD44、CD90和CD105的表达没有统计学差异(图1C),表明alphastatin慢病毒转染对Al-ADSCs的干细胞特征没有明显影响。

图1 基于ADSC的alphastatin肽胶质瘤靶向载体特征的鉴定Fig.1 Characterization of the ADSC-based alphastatin peptide glioma targeting vector

2.2 基于ADSC的alphastatin肽胶质瘤靶向载体对GSCs的趋向性

如图2所示,通过流式细胞仪从U87和SHG44胶质瘤细胞系中分离出CD133+GSCs(图2C)。细胞迁移实验表明,与普通胶质瘤细胞或正常细胞相比,ADSCs及Al-ADSCs对GSCs的趋向性更加明显,ADSCs对于SHG44、U87、HLF-1、GSCs SHG44、GSCs U87的迁移细胞数分别为66.87±3.06、77.20±1.59、32.93±1.42、100.13±0.50、109.47±2.55,Al-ADSCs则分别为68.13±2.20、76.33±2.14、30.87±1.50、99.33±1.17、106.67±2.41,不同目标细胞组间比较差异具有统计学意义(图2A、图2B,P＜0.01)。ADSCs及Al-ADSCs在GSCs趋向性上差异无统计学意义(图2B,P＞0.05),这表明转染alphastatin慢病毒后,基于ADSC的alphastatin肽胶质瘤靶向载体(Al-ADSCs)仍保留与普通ADSCs相同的GSCs趋向性。

图2 基于ADSC的alphastatin肽胶质瘤靶向载体对GSCs趋向性鉴定Fig.2 The identification of GSCs tropism by the ADSC-based alphastatin peptide glioma targeting vector

2.3 Al-ADSCs在体外对内皮细胞血管生成的影响

如图3所示,管腔形成实验中,Al-ADSCs可以抑制体外HUVECs介导的血管生成,管腔计数示空白对照组(13.33±0.76)个/HPF,ADSCs组(19.40±1.71)个/HPF,Al-ADSCs组(7.27±0.31)个/HPF,与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01)。

图3 基于ADSC的alphastatin肽胶质瘤靶向载体对内皮细胞体外血管生成的抑制Fig.3 Inhibition of ECs angiogenesis by the ADSC-based alphastatin peptide glioma targeting vector in vitro

3 讨 论

目前已经证实,alphastatin肽对多种类型的肿瘤如胃癌[10]、乳腺癌[11]、胶质瘤[5,12]等都具有抗肿瘤作用,这主要是通过其抗血管生成作用实现的。Alplastatin肽不仅可以抑制肿瘤新生血管生成,也能引起现有肿瘤血管的退化[12]。本课题组前期研究中使用慢病毒转染内皮细胞来表达alphastatin肽[5,12]。研究发现,重组慢病毒介导的alphastatin基因转导可显著抑制胶质瘤生长和肿瘤血管生成[5,12]。但是,要最大限度地将alphastatin的抗肿瘤作用应用于临床实践,还必须找到一种合适的药物传递方式。

近年来,药物传递系统(drug delivery system,DDS)在提高药物疗效方面显示出极大的潜力。DDS能够显著增强药物的药理作用,同时减少其副作用[13]。与传统的DDS 相比,以细胞为载体的DDS具有许多的优势,如在体内血液循环中可维持较长的作用时间,具有丰富的表面配体,具有肿瘤靶向性,易于通过血脑屏障等生物屏障[14]。ADSCs便是其中一种细胞载体DDS。ADSCs具有易于制备、可供自体移植、便于进行基因修饰等特点,被认为是一种良好的胶质瘤靶向DDS[15]。

本研究使用慢病毒载体感染ADSC 以构建Al-ADSCs。结果表明,经alphastatin慢病毒转染并不会影响ADSCs的干细胞特征及其对GSCs的趋向性。同时,Al-ADSCs可以成功表达和分泌alphastatin 肽。这些结果表明,Al-ADSCs 已经初步构建成功。

随后,我们研究了Al-ADSCs对体外内皮细胞血管生成的影响。结果表明,基于Al-ADSCs在体外能够抑制内皮细胞血管生成。前期研究表明,alphastatin肽抗血管生成的机制主要是通过在血管生成的初始阶段阻断C-JUN N-末端激酶(JNK)和细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化[5],从而影响内皮细胞膜上VE-cadherin 的功能,进而抑制内皮细胞迁移和分化[12]。另有学者证实,alphastatin肽可以下调内皮细胞鞘氨醇激酶(SPK)活性并减少鞘氨醇1-磷酸盐(S1P)产生,从而抑制内皮细胞血管生成[10]。有趣的是,我们发现ADSCs能够促进内皮细胞体外血管生成,这与之前的报道相一致[16-17]。而在alphastatin肽存在的情况下,ADSCs的这种对内皮细胞血管生成的促进作用被抑制。ADSCs对内皮细胞的促进作用主要是通过其外泌体中多种促血管生成因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等实现的[17],而alphastatin肽能够抑制VEGF或碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)介导的内皮细胞迁移及分化,这可能是alphastatin肽能够抑制ADSCs对内皮细胞血管生成促进作用的机制之一,其具体机制有待进一步研究。

总之,本研究成功构建了Al-ADSCs,并在体外初步证实了其对内皮细胞血管生成的抑制作用。在后续研究中,将在胶质瘤动物模型中进一步验证这一靶向载体的胶质瘤趋向性及其抗肿瘤作用。