白藜芦醇通过抑制PARP1促进胰腺癌对吉西他滨的化疗敏感性

武帅,周灿灿,韩亮,马清涌,仵正

(西安交通大学第一附属医院肝胆外科,陕西西安 710061)

胰腺癌恶性程度高,占肿瘤相关致死率的第4位,5年生存率不足10%[1]。目前胰腺癌治疗手段局限,手术切除率不足20%,以吉西他滨(gemcitabine,GEM)为基础的化疗方案仍然是胰腺癌辅助治疗的一线措施[2]。而吉西他滨化疗耐药问题严重影响胰腺癌辅助治疗的效果,迫切需要一种安全有效的胰腺癌化疗增敏治疗方案。

吉西他滨是脱氧胞嘧啶的类似物,目前认为其杀伤肿瘤细胞的主要原理是作用于细胞的G1/S期,掺入双链DNA,引起DNA 断裂损伤从而诱发肿瘤细胞凋亡[3]。因此,DNA 损伤修复增强在胰腺癌对吉西他滨化疗耐药中发挥着重要作用[4]。

白藜芦醇(resveratrol,RSV)是一种天然存在的多酚化合物,具有抗肿瘤活性,已被证实有抑制胰腺癌增殖、侵袭和干细胞特性等生物学特性[5-6]。基于此,本研究以胰腺癌化疗耐药细胞株为研究对象,挖掘胰腺癌吉西他滨化疗耐药中的关键分子通路,检测白藜芦醇与吉西他滨的协同效应及可能的分子机制,并借助蛋白质对接模型预测白藜芦醇发挥作用的靶点,以期为胰腺癌化疗增敏方案提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人源性胰腺癌Mia PaCa-2细胞系中科院上海生命科学院细胞库。白藜芦醇(德国Sigma公司),溶剂为DMSO;吉西他滨(美国MCE),溶剂为DMSO;DMEM 培养基、胰酶均购自美国Gibco;胎牛血清(美国HyClone);彗星实验相关试剂(美国Trevigen);CCK-8(美国Glpbio);Anti-β-actin(美国Proteintech),Anti-PARP1(美国Proteintech)。

1.2 实验方法

1.2.1 胰腺癌化疗耐药细胞株的构建 Mia PaCa-2作为亲本,采用吉西他滨持续低浓度递增诱导法筛选耐药细胞株。起始细胞培养基中吉西他滨浓度为10 nmol/L,每传代一次,药物浓度递增10 nmol/L,逐步增加浓度至4μmol/L,检测该细胞株与同期传代亲本细胞(Mia WT)对吉西他滨药物的半抑制浓度(IC50)具有显著差异,由此获得胰腺癌吉西他滨化疗耐药株(Mia GR),共历时10个月。

1.2.2 胰腺癌化疗耐药细胞株 RNA-seq及KEGG分析提取Mia GR和Mia WT的RNA,每组设置3个重复,进行高通量RNA 测序。使用DEGSeq进行的差异表达分析,以log2 Fold Change≥1同时q＜0.05的基因作为显著差异表达基因。进一步针对差异表达基因进行KEGG 富集分析,使用David 在线分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)寻找差异表达基因中显著性富集的通路。

1.2.3 细胞增殖检测及药物协同指数计算 取生长状态良好的细胞,以2×103/孔的细胞密度种植于96孔板,细胞贴壁给予不同药物干预处理48 h及96 h后,吸弃原培养基,每孔加入含10%CCK-8的新鲜培养基100μL,在培养箱中避光37℃孵育2～3 h后,使用酶标仪检测450 nm 处的吸光度。使用基于Chou-Talalay药物联合作用定量方法的CompuSyn 软件分析药物联合干预的协同指数(combination index,CI),并绘制抑制率-联合指数图(Fa-CI图)及等效线图(isobologram 图)。

1.2.4 Western blotting检测蛋白表达 使用RIPA裂解法提取干预处理后细胞总蛋白,BCA 法测定蛋白浓度并调齐,加入上样缓冲液并100℃10 min煮沸变性。经过凝胶电泳分离及转膜使蛋白转移至PVDF膜。封闭后按1∶1 000稀释一抗,4℃孵育过夜,洗膜后转入1∶5 000稀释二抗中室温孵育2 h后洗膜,使用化学发光仪检测其蛋白表达。

1.2.5 小分子与蛋白质分子对接模型 使用RCSB蛋白数据库(https://www.rcsb.org/)获取蛋白质或与其配体结合的三维结构模型。利用Pymol软件获得蛋白质单体结构,并转化为PDBQT 格式。从Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取小分子三维结构模型mol2格式。使用AutoDock软件进行AutoGrid及AutoDock评价配体与受体空间几何和能量匹配的相互结合作用,寻找最佳结合方式。使用Pymol软件展示小分子与蛋白质结合的作用方式及空间构像。

1.2.6 彗星实验 取洁净的磨砂处理载破片,铺设第一层0.5%的加热融化的普通熔点琼脂糖凝胶100μL,置于4℃凝固备用。取生长状态良好的细胞,经过适当干预刺激后,离心重悬并计数,使细胞密度为1×106/mL。取上述细胞混悬液10μL加至提前预热37℃融化的低熔点琼脂糖75μL中,混匀后覆盖至第一层普通琼脂糖凝胶表面,置于4℃使其凝固。加入细胞裂解液在4℃裂解1 h。小心清洗3次后,加入碱性电泳液20 min,使DNA 在电泳前解旋,恒流300 m A电泳25 min,使用PBS缓冲液中和15 min,清水洗去除多余盐分,保持湿润状态下滴加DNA 染料碘化丙啶20μL,盖上载玻片,荧光显微镜下使用绿光观察。

1.3 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0软件进行数据分析。数据符合正态性及方差齐性,实验结果采用均数±标准差表示。两组间比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用One-way ANOVA 单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,采用Chou-Talalay 法进行药物联合作用定量分析。以P＜0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 吉西他滨化疗耐药的胰腺癌细胞株的构建、鉴定及RNA-seq结果分析

经吉西他滨持续低浓度递增诱导法干预胰腺癌细胞10个月获得胰腺癌化疗耐药细胞株(Mia GR)。设置吉西他滨浓度梯度(0～20μmol/L),CCK8法检测与同期传代的对照亲本(Mia WT)在加药48 h及96 h的吸光度,IC50显示Mia GR对吉西他滨的IC50明显高于Mia WT(48 h:1.029μmol/Lvs.0.014μmol/L;96 h:0.385 4μmol/Lvs.0.005 6μmol/L),Mia GR 的耐药指数(Resistance Index,RI)在48 h和96 h分别为73.3和68.8(图1A、图1B)。

高通量RNA-seq结果显示,Mia GR 相较于Mia WT,差异表达基因3 985个,其中上调1 559个,下调2 426个(图1C)。KEGG 分析显示,差异表达基因富集于DNA replication、Homologos recombination等于DNA 损伤修复相关通路(图1D),提示DNA 损伤修复相关基因在胰腺癌吉西他滨化疗耐药中可能发挥关键作用。

图1 胰腺癌吉西他滨化疗耐药细胞株的鉴定及RNA-seq分析结果Fig.1 Validation of gemcitabine resistant pancreatic cancer cell lines and results of RNA-seq analysis

2.2 白藜芦醇增强吉西他滨诱导的胰腺癌细胞DNA损伤作用

白藜芦醇具有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭等作用,其是否能够增强吉西他滨诱导的DNA损伤,从而增敏胰腺癌化疗尚不清楚。分别给予胰腺癌细胞RSV 60μmol/L、GEM 1μmol/L、RSV 60μmol/L+GEM 1μmol/L联合干预,48 h后进行彗星实验。结果显示,相较于对照组(P＜0.001)及单独使用白藜芦醇(P＜0.001)或吉西他滨组(P＜0.01),白藜芦醇+吉西他滨联合干预组彗星拖尾所占总面积百分比明显升高,即DNA 损伤明显增强(图2),提示白藜芦醇能够增强吉西他滨诱导的DNA 损伤作用。

图2 彗星实验检测药物引起的DNA损伤Fig.2 Comet assay that reflects the DNA damage caused by drugs

2.3 白藜芦醇抑制耐药关键分子PARP1并协同吉西他滨化疗

PARP1是参与DNA 损伤修复的关键分子。Western blotting检测Mia WT 和Mia GR 中PARP1表达水平,结果显示,Mia GR的PARP1表达水平明显高于Mia WT,并且在吉西他滨1μmol/L干预48 h后Mia GR的PARP1表达水平进一步升高(图3A)。这一结果提示,PARP1是导致胰腺癌对吉西他滨化疗耐药的关键分子。给予RSV 干预耐药株Mia GR 48 h后进行Western blotting检测PARP1的表达,结果显示,RSV 以浓度依赖的方式抑制吉西他滨耐药关键分子PARP1表达(图3B)。进一步使用RSV、GEM、RSV+GEM 干预MiaGR 48 h后,发现RSV+GEM可有效抑制PARP1表达水平。

为了进一步验证其是否促进胰腺癌对吉西他滨化疗增敏的作用,设置RSV 单药、GEM 单药及RSV+GEM 双药联合组,分别以浓度梯度(0、1/4 IC50、1/2 IC50、IC50、2 IC50、4 IC50)干预Mia PaCa-2细胞,使用CompuSyn软件分析,结果显示,二者在不同抑制率(Fa)的协同指数CI 值均＜1(图3D、图3E、图3F),证明白藜芦醇与吉西他滨在胰腺癌化疗中发挥协同增敏作用。

2.4 白藜芦醇与PARP1的CAT结构域存在预测结合位点

为深入研究白藜芦醇影响PARP1表达的方式,借助AutoDock软件对白藜芦醇与PARP1进行分子模拟。从RCSB 蛋白数据库获取PARP1 蛋白质催化结构域(CAT domain)与芦卡帕尼(rucaparib)的对接三维结构模型的PDB格式(PDB ID:6VKK)[7]。从Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得白藜芦醇的小分子结构mol2格式(Compound CID:445154)。进一步通过AutoDock软件,进行模拟预测白藜芦醇与PARP1 的结合方式和结合力强弱。参照PARP1与芦卡帕尼的对接口袋(图4A,图4B),设置PARP1的Grid Box,选择对接能量排序第一位(结合能:-4.55 kcal/mol)并且符合已知小分子与PARP1蛋白口袋对接模式作为对接模型。将对接模型导入Pymol软件,分析显示,白藜芦醇与PARP1的CAT 结构域共形成3个氢键,分别是与766号天冬氨酸(766 Asp)形成2.0埃米的氢键,与888号甘氨酸(888 Gly)形成2.4埃米的氢键,与904号丝氨酸(904 Ser)形成2.0埃米的氢键(图4C)。采用球面模型显示,白藜芦醇与PARP1的CAT 结构域的蛋白口袋对接(图4D),与芦卡帕尼具有相似的PARP1蛋白结合口袋位点。

图4 白藜芦醇具有与PARP1抑制剂芦卡帕尼相似的PARP1的CAT结构域对接结合位点Fig.4 Resveratrol had a PARP1 CAT domain binding site which is similar to that of the PARP1 inhibitor Rucaparib

3 讨 论

胰腺癌严重危害人类健康,WHO 预测在2030年其肿瘤相关死亡率居世界第二位[8]。目前胰腺癌治疗推荐以手术及放化疗为主要手段的多学科综合诊疗模式(MDT)[2],化疗是胰腺癌综合治疗的重要手段。吉西他滨在胰腺癌的应用是里程碑式的事件[9],以吉西他滨为基础的化疗仍作为指南推荐的一线化疗方案之一[2],但吉西他滨面临严重的化疗耐药问题,化疗响应率仅7%～8%[10]。

胰腺癌化疗耐药的原因主要有外源性因素及内源性因素[11]。外源性耐药机制是指非肿瘤细胞因素造成的胰腺癌化疗耐药,主要包括由于肿瘤基质纤维丰富而乏血供的肿瘤微环境而引起的胰腺癌药物灌注扩散障碍、肿瘤细胞外药物代谢,以及“微环境-癌细胞交互”引起的肿瘤细胞外源性耐药机制加强。内源性耐药机制是细胞层面胰腺癌吉西他滨耐药的本质因素,指由肿瘤细胞自身因素造成的胰腺癌化疗耐药。可以归纳如下:①药物吸收与活性加工障碍;②药物代谢外排和竞争抑制;③抗凋亡和DNA 损伤修复系统增强,肿瘤细胞异常激活的抗凋亡系统与DNA 损伤修复系统是其抵御外界刺激与内生危害的重要机制,其可造成吉西他滨诱导的细胞凋亡和DNA 损伤失效[4]。本研究通过高通量RNA-seq测序发现,在吉西他滨化疗耐药的胰腺癌细胞株中存在DNA 损伤修复通路的异常激活,提示DNA 损伤修复系统增强在吉西他滨化疗耐药中发挥关键作用。同时,借助彗星实验也发现,白藜芦醇可以增强吉西他滨诱导的DNA 损伤作用,初步提示白藜芦醇具有吉西他滨增敏作用。

DNA损伤修复涉及的关键分子包括PARP(poly ADP-ribose polymerase)家族和BRCA 基因家族等。PARP家族中最重要的成员是PARP1,PARP1通过识别结构损伤的DNA 片段而被激活,被认为是DNA 损伤的感受器,参与DNA 修复,具有维持基因组稳定功能[12]。本研究发现,吉西他滨化疗耐药细胞株在基础状态的PARP1显著高于亲本细胞株,并且在吉西他滨干预后耐药细胞株的PARP1 水平进一步升高,提示PARP1是胰腺癌吉西他滨化疗耐药的关键分子。PARP1也作为凋亡执行分子caspase-3的切割底物,被切割为cleaved-PARP1,包含26 ku和89 ku两个片段,使其丧失DNA 修复功能,细胞转向凋亡过程。本研究发现,白藜芦醇抑制耐药细胞株PARP1的表达水平,从而增加耐药细胞株对吉西他滨的敏感性。

与吉西他滨单药治疗相比,吉西他滨联合治疗具有更高的治疗响应率,增加了无进展生存期和总生存期[13]。PARP抑制剂奥拉帕利(Olaparib)已经被美国国家综合癌症网络(NCCN)指南批准可用于BRCA 基因检测突变的胰腺癌患者的维持治疗[2,14]。芦卡帕尼是最早进入临床试验的PARP 抑制剂,被美国食品药品监督管理局(FDA)于2016 年加速审批上市,目前主要用于难治性晚期卵巢癌患者[15]。本研究证实白藜芦醇可以促进吉西他滨化疗增敏,进一步通过构建白藜芦醇与PARP1的CAT 结构域的对接模型,同已发表的芦卡帕尼与PARP1 的CAT结构域对接模型[7]进行比对发现,白藜芦醇与芦卡帕尼二者在PARP1的CAT 结构域具有相似的结合靶点,作用于位置相似的蛋白质口袋,该发现为白藜芦醇抑制PARP1的DNA 损伤修复功能提供蛋白质靶点信息,同时也为白藜芦醇与吉西他滨发挥化疗协同增敏作用提供内在可能的分子机制。

综上所述,胰腺癌吉西他滨化疗耐药形成的关键环节之一是PARP1等介导DNA 损伤修复相关通路增强,白藜芦醇抑制PARP1表达从而增敏吉西他滨化疗,并发现白藜芦醇与PARP1 存在分子结合靶点,为白藜芦醇作为吉西他滨化疗增敏剂提供可能的理论依据。但各项研究尚处于体外研究阶段,需要体内实验和转化研究进一步证实白藜芦醇在胰腺癌吉西他滨化疗的增敏作用。