双白莲合剂中对香豆酸的含量测定及其抑制食管癌细胞生长的机制

郑伊琳,姚笑睿,辛淑波,李庆南,黄国鑫

(汕头市中心医院,广东汕头 515000)

食管癌(esophagus cancer,EC)是我国居民临床好发的恶性肿瘤类型之一。根据国家癌症中心发布的2018年全国癌症统计数据显示,食管癌位列我国恶性肿瘤发病率的第5位,致死率位列第4位[1]。由于EC发现晚、致死率高及预后差等特点,给我国国民的经济与人民健康造成严重的负担。临床上针对EC治疗主要包括手术、放化疗、靶向、免疫疗法等,但由于基因、病理病因等个体差异,复发、耐药及药物毒副作用等仍然是困扰临床治疗的难题[2]。近年来,源于中药的有效成分、有效部位以及复方中药的制剂,因其安全有效、低毒副作用等优点,越来越受到重视。中药制剂的使用,在多种癌症的治疗与辅助治疗中日益普遍。

双白莲合剂为我院自主研发的院内制剂(制剂批准文号:粤z20070031),其组方含半枝莲、白花蛇舌草、两面针和白英,在本院已有20多年的使用记录。双白莲合剂功效为祛瘀散结、消肿止痛、清热解毒,临床上广泛用于多种癌症的治疗与辅助治疗。通过近5年来该合剂1 041 例患者的使用与随访记录发现(图1),双白莲合剂主要使用患者为EC 患者(占比55.6%),可有效提高癌症患者的生存率。但由于该合剂是我院早期申请生产使用的院内制剂,在成分分析、质量控制及其抗癌作用机制方面缺乏深入的研究。因此,完善双白莲合剂质量标准和抗癌活性作用机制研究是其在临床上安全有效地运用的重要保障。在前期运用高效液相串联飞行质谱的研究中发现,双白莲合剂主要成分为对香豆酸(pcoumaric acid,PCA)、咖啡酸(caffeic acid)、阿魏 酸(ferulic acid)和山柰素(kaempferitin)等。本研究以对香豆酸为研究对象,采用高效液相色谱法对其在双白莲合剂中的含量进行分析测定,并通过细胞实验和动物实验方法对其抑制食管癌细胞的作用机制进行研究。

图1 我院近5年来双白莲合剂使用患者群的分布情况Fig.1 The distribution of patients treated with Shuang Bailian mixture in Shantou Central Hospital in recent 5 years

1 材料与方法

1.1 试剂

双白莲合剂为汕头市中心医院院内中药制剂,组成药材为半枝莲、白花蛇舌草、两面针、白英(白毛藤)。半枝莲为唇形科植物半枝莲ScutellariabarbataD.Don的干燥全草(批号:20180601),白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa(Willd)Roxb.的干燥全草(批号:20180601),两面针为芸香科植物两面针Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.的干燥根(批号:20180801),均购于广东汇群中药饮片股份有限公司;白英为茄科植物白英Solanum lyratumThunb.的干燥全草(批号:180801861),购于康美药业股份有限公司。对香豆酸对照品(批号:B20335-20 mg;含量HPLC≥98%),购于上海源叶生物科技有限公司;顺铂(DDP,批号:601200663,江苏豪森药业集团有限公司),乙腈、磷酸为色谱纯;水为屈臣氏蒸馏水。KYSE30和KYSE140食管癌细胞株(中国科学院上海细胞库);细胞培养基为Gibco 100 mL/L胎牛血清含量的Hyclone 1640培养基;细胞株消化传代采用Gibco胰酶;Cell Counting Kit 8(CCK8)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(博士德生物有限公司);cleaved caspase 3、cleaved P ARP、Bad、Bcl-2、p-PI3K 和p-AKT抗体(Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 仪器

LC-20AT 高效液相色谱仪(日本岛津公司),KQ5200DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),VORTEX-5涡旋混合器(其林贝尔仪器制造有限公司),PHS-3E pH 计(上海仪电科学仪器股份有限公司),ME204E电子分析天平(200 g/0.1 mg)[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司],5418R高速冷冻离心机(艾本德中国有限公司),1374II级A2型生物安全柜(赛默飞世尔科技有限公司),MCO-20AIC二氧化碳培养箱(日本松下公司),IX73荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯公司),TC-20 自动细胞计数仪(美国伯乐公司),PowerPac 300电泳仪(美国伯乐公司),VCX130 Vibra cell超声破碎仪(美国SONICS公司),Multiskan FC酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司),ChemiDoc超高灵敏度化学发光成像系统(美国伯乐公司)。

1.3 双白莲合剂中PCA的含量测定

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(25μm,4.6 mm×250 mm);0.45μm 微孔滤膜;流动相:乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0～33 min,10%A;33～40 min,10%→100%A;40～48 min,100%A);检测波长:310 nm;进样量:20μL;流速:1.00 mL/min;柱温:40℃。

1.3.2 对照品溶液的制备 取低温干燥保存的对香豆酸对照品适量,精密称定,加100 mL/L 乙腈溶液制成浓度为1 mg/m L 的对香豆酸对照品储备液,即得标准品溶液。分别吸取上述对照品储备液适量置于量瓶中,再加100 mL/L乙腈溶液稀释成质量浓度分别为15、20、22.5、25、30、40μg/m L的混合对照品溶液,于4℃保存备用。

1.3.3 供试品溶液的制备 取双白莲合剂药材粉末(半枝莲∶白花蛇舌草∶两面针∶白英=5∶5∶2∶2,过三号筛)约0.84 g,精密称定,置具塞圆底烧瓶中,精密加入水10 mL,称定重量,加热回流1 h,放冷,摇匀,滤过,取续滤液过0.45μm微孔滤膜,即得供试品溶液。

1.3.4 标准曲线绘制 分别精密吸取“1.3.2”项下混合对照品溶液20μL,在“1.3.1”项下液相色谱条件下进样分析,记录色谱图。以峰面积A(y)对浓度C(x)进行线性回归,计算回归方程。

1.3.5 精密度试验 取对香豆酸对照品溶液,在“1.3.1”项下色谱条件连续进样6次,记录峰面积,计算峰面积的标准偏差(relative standard deviation,RSD)。RSD 采用计算结果的标准偏差除以算术平均值,用以评估试验精密度。

1.3.6 稳定性试验 取双白莲合剂供试品溶液,分别于在室温处理配制后、4℃短期储存、-20℃长期储存和反复冻融循环后进样,记录峰面积,计算峰面积的RSD。评估双白莲合剂供试品溶液中对香豆酸的稳定性。

1.3.7 加样回收率试验 取已知对香豆酸含量的双白莲合剂药材粉末各6 份(756μg/m L 原药浓度,16.84μg/m L对香豆酸含量),精密称定,分别加入已精密称定的对香豆酸对照品(对香豆酸对照品含量98%,终浓度为13.7μg/m L),按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液、“1.3.1”项下色谱条件进行测定,根据公式:回收率=(C测-C样)/C对香豆酸×100%,计算加样回收率。

1.3.8 重复性试验 取同一浓度的双白莲合剂供试品溶液,共6份,在“1.3.1”项下色谱条件进样,记录峰面积,计算峰面积的RSD,评估仪器性能。

1.3.9 双白莲合剂中对香豆酸的含量测定 精密称定,按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液,“1.3.1”项下色谱条件测定对香豆酸峰面积,按标准曲线外标法(对香豆酸标准曲线y=204 402x+360 904)计算对香豆酸的含量。

1.4 CCK8法检测PCA的抗肿瘤活性

采用1640 培养基(100 mL/L 胎牛血清)培养KYSE30、KYSE140 食管癌细胞株,置于50 mL/L CO2、37℃的细胞培养箱中,细胞株增殖至80%培养皿面后进行传代;将食管癌细胞接种于96孔板,共6组,每组6个复孔,以空白培养基为空白组,以未给药食管癌细胞为对照组,采用培养基溶液配置分别含有1、5、12.5、25、50、100μg/m L 对香豆酸的细胞培养液,分别作用于对数生长期的KYSE30、KYSE140食管癌细胞,采用CCK8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测药物干预前后肿瘤细胞增殖活性。细胞给药培养48 h后加入CCK8溶液,培养箱避光孵育1 h后用酶标仪检测不同分组的食管癌细胞在450 nm 处吸光度,计算相对细胞存活率和相对细胞抑制率、半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50),考察对香豆酸对食管癌细胞的抗肿瘤活性作用。

1.5 Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白的表达

分别将KYSE30、KYSE140细胞传代,待细胞长满培养皿80%后分别加入空白培养基、顺铂(100μg/mL)、对香豆酸(KYSE30和KYSE140细胞分别为36μg/mL和55μg/m L)、顺铂联合对香豆酸溶液,加药48 h后冰浴中加入细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂),待细胞充分裂解后收集细胞,置于微量离心管中12 000 r/min离心10 min,取上清液得肿瘤细胞总蛋白液。采用BCA 法测定细胞中蛋白含量,配平浓度制备蛋白样品。配置120 mL/L分离胶、50 mL/L浓缩胶后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,采用70 V电压待蛋白样品进入分离胶后调节电压至100 V。出现完整Mark条带后终止电泳,转膜,封闭,根据检测的蛋白分子量裁膜,分别用一抗鼠抗人β-actin、兔抗人cleaved caspase 3、兔抗人cleaved PARP、兔抗人Bad、兔抗人Bcl-2、兔抗人p-PI3K和兔抗人p-AKT,置于4℃冰箱内孵育过夜,TBST洗膜3次(每次5 min以上),二抗孵育1 h,洗膜,化学发光成像,检测。

1.6 裸鼠荷瘤实验

Nude小鼠,20只,雄性,体质量为16～20 g,由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供,许可证号为SCXK(粤)2020-0054,饲养于汕头大学医学院实验动物中心动物房。饲养环境温度25℃,湿度65%～70%,所有小鼠均可正常获取食物和水。取对数生长期的KYSE30食管癌细胞,消化后用不完全培养液配成密度不低于107/m L的细胞悬液,于裸鼠右上肢皮下注射0.2 mL 细胞悬液。每日观察肿瘤生长情况,待出瘤后,使用游标卡尺测量肿瘤体积,肿瘤体积=(D×d2)/2(D:肿瘤的长径;d:肿瘤的短径)。当肿瘤体积为80～150 mm3时,将裸鼠随机分成4组,分别为模型对照组、顺铂(DDP)对照组、对香豆酸(PCA)组、DDP 联合PCA 给药组,每组5只。实验过程PCA 每2 d口服给药1次,顺铂每3 d腹腔注射,连续30 d给药。实验过程进行数据测量和分析:每3d观察测量裸鼠肿瘤生长情况,计算肿瘤相对体积,以每组动物移植瘤体积的平均值,绘制移植瘤生长曲线。实验结束时在超净台上对裸鼠进行拍照,完整剥离肿瘤后拍照,用游标卡尺对肿瘤的大小进行测量,用电子天平称量移植瘤重量。肿瘤组织剪碎后加入RIPA裂解液,加入少量玻璃珠,冰浴上超声破碎处理10 s,静止10 s,循环6次后4℃、12 000 r/min离心5 min,取上清即为肿瘤总蛋白,进行后续Western blotting实验(条件同“1.5”项)。

1.7 统计学分析

实验数据采用SPSS 22.0、Graph Pad Prism7.0、和R 软件处理。数据以mean±SD 表示,多组间均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),采用LSD 检验或DunnettT3检验进行两两比较。荷瘤小鼠移植瘤体体积变化采用R 软件做重复测量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双白莲合剂主要成分PCA的含量测定方法建立

2.1.1 对照品及样品HPLC图谱 在“1.3.1”项色谱条件下,对香豆酸色谱峰的对称性、分离度和理论塔板数均能满足要求,对照品及样品图谱见图2。

图2 对香豆酸对照品和双白莲合剂的HPLC图Fig.2 HPLC for p-coumaric acid and Shuang Bailian mixture

2.1.2 对香豆酸线性回归分析 根据对照品溶液色谱图,以峰面积A(y)对浓度C(x)进行线性回归,得对香豆酸回归方程为y=204 402x+360 904,R2=0.995 0,结果表明,对香豆酸在15～40μg/m L 范围内呈良好线性关系(图3)。

图3 对香豆酸的峰面积A(y)对浓度C(x)的线性回归图Fig.3 Linear regression diagram of peak area A (y)to concentration C(x)of p-coumaric acid

2.1.3 精密度试验 计算对香豆酸对照品溶液峰面积的RSD,结果显示,对香豆酸峰面积的RSD为2.66%,表明仪器精密性良好。

2.1.4 稳定性试验 稳定性实验结果显示,对香豆酸在室温处理(24 h)、4℃短期储存(72 h)、-20℃长期储存(30 d)和反复冻融循环(3次)后的RSD 分别 为2.35%、3.22%、1.58%、4.08%,表明供试品溶液在前处理和贮存不同温度环境下被测物的稳定性良好,RSD 均小于5%。

2.1.5 重复性试验 计算双白莲合剂供试品溶液峰面积的RSD,结果显示,6批样品中对香豆酸峰面积的RSD 为4.01%,表明仪器重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验 根据公式回收率=(C测-C样)/C对香豆酸×100%,计算加样回收率,结果见表1。加样回收率RSD 值为6.16%,表明该方法的准确性良好。

表1 双白莲合剂加样回收率Tab.1 Recovery rate of Shuang Bailian mixture

2.1.7 双白莲合剂中对香豆酸的含量 按标准曲线外标法(对香豆酸标准曲线y=204 402x+360 904)计算双白莲合剂中对香豆酸的含量,将3批双白莲合剂样品进样后峰面积分别为3 812 004、3 873 380、3 726 394 m AU×min,代入标准曲线后计算结果见表2。计算结果显示,双白莲合剂含有对香豆酸16.84μg/m L。

表2 双白莲合剂中对香豆酸含量平均值Tab.2 The average value of coumaric acid in Shuang Bailian mixture

2.2 PCA 通过调节PI3K/AKT/Bcl-2 凋亡信号通路诱导食管癌细胞的凋亡

CCK8 实验结果显示,PCA 在食管癌细胞KYSE30和KYSE140的半数抑制率(IC50)分别为36μg/m L和55μg/m L(图4A、图4B)。KYSE30和KYSE140在分别接受DDP、PCA以及PCA 联合DDP给药48 h后,Western blotting结果显示,DDP、PCA 以及PCA 联合DDP可以有效地提高食管癌细胞KYSE30和KYSE140中cleaved caspase 3、cleaved PARP 以及Bad的蛋白表达。同时,降低Bcl-2、p-PI3K 和p-AKT 的蛋白表达。说明PCA 可以通过癌细胞凋亡信号通路PI3K/AKT/Bcl-2的调节作用,进而诱导食管癌细胞凋亡的发生(图4C-图4F)。

2.3 PCA 通过调节PI3K/AKT/Bcl-2 凋亡信号通路抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长

裸鼠荷瘤实验结果显示,给药30 d后,空白对照组小鼠移植的瘤体持续增大,而DDP 组、PCA 组以及PCA 联合DDP给药组均可有效抑制荷瘤小鼠的移植瘤体的生长(图5A-图5C)。此外,通过对剥离的肿瘤组织进行分析后,Western blotting结果显示,DDP、PCA 以及PCA 联合DDP 可以有效地提高 瘤体组织中cleaved caspase 3、cleaved PARP以及Bad的蛋白表达。同时,降低瘤体组织中Bcl-2、p-PI3K和p-AKT 的蛋白表达。说明PCA 可以通过癌细胞凋亡信号通路PI3K/AKT/Bcl-2 的调节作用,诱导癌细胞凋亡信号通路的发生,进而抑制荷瘤小鼠移植瘤体的生长(图5D、图5E)。

图5 PCA通过调节PI3K/AKT/Bcl-2凋亡信号通路抑制荷瘤小鼠移植瘤体生长Fig.5 PCA inhibited the growth of transplanted tumor in tumor-bearing mice by regulating PI3K/AKT/Bcl-2 apoptosis signaling pathway

3 讨 论

对香豆酸存在于多种药用植物以及水果和蔬菜中[3]。现有报道显示,PCA 具有许多的药理活性,主要包括抗氧化、抗炎、免疫调节、抗肿瘤、抗血小板聚集、保护心血管、预防和改善糖尿病及神经保护作用[3-5]。双白莲合剂处方中的半枝莲和白花蛇舌草等都含有该活性成分[6-7]。本课题前期采用高效液相色谱串联飞行质谱的研究中也发现,该合剂中的主要成分包括PCA、咖啡酸、阿魏酸和山柰素等。本实验以对香豆酸为质量标准研究的对象,采用高效液相色谱法建立双白莲合剂的质量控制标准。结果表明该方法稳定可控,简单可行,重现性好,可为双白莲合剂的鉴别和质量控制提供科学依据,也为双白莲合剂在临床上进一步的推广应用提供了重要保障。

诱导细胞凋亡是药物发挥抗癌活性的重要方式。PI3K/AKT/Bcl-2信号通路是细胞凋亡发生的重要通路[8-9]。癌基因Bcl-2(即B 细胞淋巴瘤/白血病-2基因)具有明显抗细胞凋亡的作用。研究显示,抑制Bcl-2蛋白的表达,可上调Caspase-3和Caspase-9的表达,激活内源性线粒体外膜通透性,促使癌细胞凋亡的发生[10]。本研究通过体内外实验证明,PCA 可以通过调节PI3K/AKT/Bcl-2 凋亡信号通路,诱导食管癌细胞KYSE30和KYSE140的凋亡,进而有效抑制癌细胞的生长。此外,小鼠荷瘤实验也证明,PCA 可以有效抑制荷瘤小鼠移植肿瘤的生长,PCA可以诱导凋亡信号通路上相关蛋白的表达,抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。本研究进一步丰富了双白莲合剂发挥抗癌活性的物质基础研究,为其临床应用提供了实验数据支持。