基于网络药理学及数据挖掘分析生地黄-牡丹皮-甘草治疗寻常型银屑病的机制*

蔺莉，闫小宁，李文彬，杨霄，张书婵

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中医医院，陕西 西安 710003）

银屑病（psoriasis），亦称牛皮癣，中医称之为白疕，该病为临床常见的慢性皮肤病，发病机制复杂且易复发[1]。中医学将致病因素分为外感、血热、毒蕴三方面[2-4]。银屑病发病以冬春最显著，近些年发病率呈上升趋势[5]。现代中医学则主要将银屑病分为血热、血瘀、血燥3种证型[6]。

中医学治疗银屑病处方思路独具特色，并具有安全性高、疗效佳等优点，根据中医学的辨证论治原则，银屑病在不同的发展阶段有不同的临床特点，应在不同发病阶段采用不同的治疗方法[7]。然而，由于临床经验的差异和中药的复杂性，处方之间存在很大的差异。本研究基于数据挖掘的方法，从大量经过临床证实有效的处方中挖掘出最核心的药对，即生地黄、牡丹皮、甘草。其中生地黄、牡丹皮属于清热类药物，均具有清热凉血的功效，甘草是补虚类中药，具有补脾益气、清热解毒、缓急止痛的功效。三药配伍，共奏清热凉血之功效，且三味药物均具有抗炎、抗氧化等药理作用。本研究运用网络药理学及分子对接的方法，对生地黄、牡丹皮、甘草的作用机制进一步探索，探讨核心药对治疗寻常型银屑病的主要活性成分及作用靶点，为临床优化用药和筛选新化合物提供依据。

1 资料和方法

1.1 数据来源 从CNKI数据库中收集治疗寻常型银屑病的中药处方。文献检索按主题、标题和摘要进行，搜索关键词“中药”或“中草药”并“方药”或“处方”并“寻常型银屑病”；时间跨度从数据库建库至2021年3月5日。

1.2 纳入标准（1）首次诊断为寻常型银屑病；（2）口服中药汤剂治疗寻常型银屑病的临床研究；（3）处方应有效。以治疗组与对照组疗效相比是否具有统计学意义为界定标准。

1.3 排除标准（1）文献综述；（2）实验研究；（3）未公布具体中药处方或处方数据不完整。

1.4 数据分析 从符合条件的研究中提取出中药处方，并建立数据库。然后用SPSS软件进行频率分析。应用SPSS Modeler软件进行数据结果可视化，运用Apriori建模进行关联规则分析，从所有处方中识别出治疗寻常型银屑病的核心中药组合。通过GEO数据库整理找出寻常型银屑病的差异基因，通过TCMSP、Batman-TCM数据库检索核心配伍的主要化合物成分和作用靶点，并在GeneCards数据库、OMIM数据库、DrugBank数据库和Disgenet数据库检索寻常型银屑病的相关靶点。将差异基因与寻常型银屑病基因靶点与核心药对组合靶点进行合并取交集，对核心药物组合治疗寻常型银屑病的潜在作用靶标进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，使用Cytoscape软件构建“疾病-药物-活性成分-靶点”网络图和活性成分与疾病共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions，PPI）网络，得出最具活性化合物及核心靶点后，通过Auto Dock工具（v.1.5.6）和PyMOL（v.2.3）制备受体和配体，然后通过Autodock Vina（v.1.1.2）进行对接验证，评价配体与靶蛋白结合强度的亲和力，用Pymol 2.3对对接构象进行了可视化分析并提供最佳构象。

2 结果

2.1 数据筛选 共获得890项研究。根据上述纳入和排除标准筛选，最终纳入175项研究，并提取出治疗方剂178首。参照2015年版《中华人民共和国国药典》一部和《中药学》对178首方剂中的药物名称进行统一。

2.2 处方用药频数及药物功效分析 对中药名称进行规范化处理后，共提取出259种中药，累计出现频数2 076次，取用药频数在前10%的中药作为高频药物，共27种（频数≥18），累计频数1 288次（占总频数的62.04%）。单味中药具体使用情况见表1，其中使用频率最高的前五味中药分别是生地黄（64.61%）、甘草（56.18%）、赤芍（50.56%）、牡丹皮（50.56%）、土茯苓（42.70%）。27味中药主要以清热药为主，其次是活血化瘀药、解表药、补虚药等。

表1 单味中药的使用情况（频数≥18）

2.3 高频药物药性、药味及归经分析 27味高频中药的药性主要以寒、温、平为主，其中寒性占比最高，但未出现凉性及热性；药味主要以甘、辛、苦为主，其中苦味出现最多，未见酸性药物；药物归经主要以肝经为主，占25.35%，其次是心经（21.13%）、胃经（12.68%）。（见图1）

图1 高频中药性味、归经分布图

2.4 基于关联规则分析高频中药组方规律 应用SPSS Modeler软件对高频药物（使用频数≥18）进行关联规则分析，药物间关联规则网络见图2，Apriori算法是关联规则挖掘的经典算法，基于Apriori规则，设置支持度为20，置信度为80%，最大前项数为5，最终在178首方剂中提取出14个核心药物组合，潜在药物组合的提升度均大于1，具体参数见表2，说明这些药物组合在统计学上差异均有统计学意义。其中置信度最高的组合是“生地黄-牡丹皮-甘草”。

表2 高频药物关联规则组合

图2 高频中药关联规则网络

2.5 核心药物组合网络药理学机制分析

2.5.1 寻常型银屑病差异基因、作用靶点及核心药物组合活性成分、作用靶点收集 以“psoriasis vulgaris”为关键词，检索GEO数据库，下载GSE7610（有机体：智人）的基因芯片数据原始文件，数据共26个样本。样本采用GPL96人类基因表达阵列平台检测，13例正常对照组，13例疾病组。以logFC与P值作为筛选条件，所筛选出的基因被视为有显著差异表达基因，利用R语言软件绘制火山图及热图进行差异基因可视化。（见图3）其中无显著表达差异的基因标记为黑点，在寻常型银屑病皮肤样本中表达上调的差异基因标记为红点，共有58个，下调为蓝点，共115个。最终得出差异表达基因共173个。

图3 寻常型银屑病差异基因表达火山图

“生地黄-牡丹皮-甘草”是核心药物组合，在中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP、Batman-TCM搜索三味中药的生物活性化合物，无法在数据库搜索到的中药，通过文献查找补充，并通过SwissTarget Predicition平台预测化合物靶点。在TCMSP数据库的基础上，以口服生物利用度（OB）≥30%和药物相似度（DL）≥0.18为筛选标准，根据药物动力学参数（ADME），筛选出候选化合物。利用UniProt数据库将所有目标名称转换成基因符号用于后续研究。并以寻常型银屑病为搜索词，查询GeneCards数据库、OMIM数据库、DrugBank数据库和Disgenet数据库，将搜索结果合并，删除重复序列，从而得出核心中药和寻常型银屑病之间的重叠目标，共得到1 075个寻常型银屑病相关目标。将差异基因与寻常型银屑病基因靶点与“生地黄-牡丹皮-甘草”药物组合靶点进行合并取交集并制作Venn图（见图4），得到药物组合与数据库中寻常型银屑病相关靶点、GEO差异基因的交集有108个。

图4 疾病靶点及共同靶点Venn图

2.5.2 “疾病-药物-活性成分-靶点”网络和PPI网络分析 本研究构建了两个网络，均使用Cytosscape3.8.2构建图解网络，并利用网络分析仪插件计算的网络拓扑参数，用度值结合其他拓扑参数来描述网络中节点的重要性，从而筛选出主要的生物活性化合物和目标。（1）“中药-生物活性化合物-疾病治疗靶点”网络显示了“生地黄-牡丹皮-甘草”、生物活性化合物和治疗靶点之间的相互作用。该网络由202个节点（3个中药，91个生物活性化合物，108个靶标）和933条边组成。（见图5）91个生物化合物度值见表3，其中槲皮素及山奈酚的交互作用最明显，槲皮素的作用靶点最多，度值为172，其次是山奈酚度值为70。表4显示了最具交互作用的10个生物活性化合物的信息。（2）蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络显示了治疗靶点之间的相互作用。用检索工具对治疗靶点的PPI数据进行分析，以检索相互作用的基因/蛋白质平台（String），将物种确定为“智人”，最低置信度设置为0.9，根据PPI结果进行分析。结果显示16个目标没有参与蛋白质相互作用，最终的PPI网络由92个节点和420条边组成。（见图6）对PPI网络中的节点进行拓扑参数筛选，分别取Degree、Average Shortest Path Length、Betweenness centrality、Closeness centrality四项参数中位数，分别是7、2.527 472 53、0.004 839 895、0.395 652 17。以Degree值大于2倍中位数，其余各项参数参照中位数进行筛选，其中17个目标符合条件，是该网络的主要指标。（见图6）主要靶点与其他蛋白质广泛相互作用，提示它们在寻常型银屑病的发生、发展中起着重要的作用，其中STAT3、TNF及JUN三项占网络中作用最突出，所以将其作为最具桥梁作用的靶点与核心化合物进行分子对接。

表3 生物活性化合物及其Degree值

表4 前10 个生物活性化合物及其参数

图5 “药物-生物活性化合物-疾病靶点”网络图

图6 PPI 网络及核心靶点条形图

2.5.3 GO功能富集与KEGG通路富集分析 为了阐明核心中药对寻常型银屑病的治疗机制，利用注释、可视化和集成发现数据库（DAVID）对108个治疗靶点进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）途径富集分析。其中GO富集分析由细胞成分（CC）、分子功能（MF），生物过程（BP）三部分组成，结果数值P＜0.05和错误发现率（FDR）＜0.05被认为是显著的，经过筛选后共得出266个BP条目，21个CC条目及40个MF条目。此外，106个KEGG途径条目得到丰富，其中许多是特定类型癌症的途径。选取GO富集每项中前五项最显著的条目，使用R软件的“gg plot 2”软件包绘制条形图（见图7），GO分析结果表明，对BP来说，主要以RNA聚合酶2启动子转录正调控、基因表达正调控、药物反应、炎症反应、缺氧反应等条目为主，主要参与基因表达、转录及凋亡等的调控；对MF来说，靶点主要负责酶结合、相同蛋白结合及提高蛋白同源二聚化活性、细胞因子活性等；CC的靶点主要分布于胞外间隙、胞外区、细胞质、膜筏等。并选取前10项最丰富KEGG通路绘制气泡图（见图8），由图可见，KEGG通路主要以癌症相关通路、TNF信号通路、乙型肝炎等通路为主。

图7 GO 富集分析图

图8 KEGG 富集分析气泡图

2.6 核心化合物-核心靶点的分子对接验证 为评估核心中药的主要生物活性化合物与关键靶蛋白的结合势，从蛋白质数据库（PDB）下载STAT3、TNF、JUN 3种目标蛋白-原配体复合物的三维晶体结构，保存为“.pdb”文件，通过TCMSP数据库查询主要目标生物活性化合物的Pubchem ID，并通过Pubchem数据库查询目标生物活性化合物的三维分子结构，并以SDF格式保存，使用Open Babel 2.4.1将该格式转换为“.mol2”格式。配体和受体是通过AutoDock工具（v.1.5.6）和PyMOL（v.2.3）制备的，制备受体的工作包括从受体晶体结构中删除原配体和水分子，添加非极性氢，计算Gasteiger部分电荷，所制备的受体和配体均以pdbqt格式保存。

然后，用AutodockVina（v.1.1.2）评价配体与靶蛋白结合强度的亲和力。亲和力＜-5.00 kcal/mol表示结合强度好，亲和力＜-7.00 kcal/mol表示结合强度令人满意。两个生物活性化合物与核心靶点的结合力见表5，用Pymol 2.3对对接构象进行了可视化和分析。（见图9）

表5 槲皮素、山奈酚与STAT3、TNF、JUN 分子对接评分（单位：kcal/mol）

图9 分子对接构象图

3 讨论

本研究主要分为两个部分，以实现从临床经验到分子机制的推论。第一部分是通过数据挖掘从丰富的中药处方中找出寻常型银屑病的治疗方药。第二部分从网络药理学的角度推导了核心中药对寻常型银屑病的治疗靶点和作用机理。首先，利用数据挖掘的方法，对中药治疗寻常型银屑病的中药处方进行分析，其中使用频数最高的有生地黄、甘草、赤芍、牡丹皮、土茯苓等。对使用频数排在前10%的27味中药进行分析，统计其药味、药性及归经。高频药物的药性主要以寒、温、平为主，药味主要以甘、辛、苦为主，归经主要以肝经为主。根据中药的使用频率和关联规则，确定了生地黄-牡丹皮-甘草作为核心药物组合，其中生地黄、牡丹皮属于清热类药物，均具有清热凉血的功效[8]，甘草是补虚类中药，具有补脾益气、清热解毒、缓急止痛的功效[9]。中医学认为白疕表现出的斑疹、脱屑为热入血分的表现，往往从血瘀、血热、血燥立法选方，清热凉血类中药在治疗寻常型银屑病时常被选择。随着对白疕的认识与治疗经验的丰富，情志因素对银屑病发展的影响被越来越重视，而肝主情志，在疏达气机方面起着至关重要的作用，因此肝经药物在治疗银屑病中使用频率较高[10]。

通过从GEO数据库收集关于寻常型银屑病的数据集，筛选出差异基因并进行分析，与PV疾病数据库收集靶点及生地黄-牡丹皮-甘草的靶标进行合并并取交集，得到的重叠目标被认为是潜在的治疗目标。对重叠目标进行GO和KEGG功能富集分析，结果表明，治疗靶标可能主要参与基因表达、转录及凋亡等的调控。涉及的信号途径主要包括TNF信号通路及其他与肿瘤相关通路等。其中肿瘤坏死因子（TNF）是银屑病发病的重要炎症细胞因子[11]。

本研究结果表明生地黄-牡丹皮-甘草药对共有91个生物活性化合物，对Degree值排名前十的活性成分进行分析。主要的生物活性化合物是类黄酮，已有研究证实槲皮素、山奈酚、刺芒柄花素、柚皮苷、甘草查尔酮A等黄酮类化合物具有明显的抗银屑病作用[12-13]，这些化合物具有诱导细胞凋亡、抗炎和抗氧化的作用。其中，槲皮素具有抗炎、抗氧化、舒张血管、保护肝脏和抗癌等药理作用[14]，其作用机制可能与改善抗氧化和抗炎状态及抑制NF-κB信号通路的激活有关。山奈酚是一种天然的黄酮醇，具有很强的抗炎、抗氧化和抗癌作用[15]，可以减少牛银屑病病变中CD3+T细胞的浸润及主要促炎性细胞因子（IL-6、IL-17A和TNF-α）的基因表达。此外，山奈酚还能下调皮肤中的促炎性核因子κB（NF-κB）信号。刺芒柄花素同样具有抗炎的作用[16]。柚皮苷是一种具有3个羟基部分的黄烷酮类似物，可以抑制IL-6过表达，达到基线控制。此外，柚皮苷还具有免疫调节，抗炎作用，可以降低银屑病患者hPBMC中的mRNA表达和所有促炎细胞因子的产生[17]。甘草查尔酮A可以诱导ROS的形成并具有抗氧化作用。

核心药对的活性成分共对应273个靶点，与寻常型银屑病相关基因靶点及GEO差异基因的交集有108个。其中STAT3、TNF、JUN、AKT1、TP53等被确定核心药对治疗寻常型银屑病的主要目标，并在PPI网络中作出了重要贡献，其中信号转导与转录激活因子3（STAT3）是一种重要的转录因子。该因子介导了大多数参与银屑病发病的细胞因子的信号，包括白细胞介素（IL）-23/IL-17/IL-22轴，在角质形成细胞过度增生与异常分化、与炎症细胞相互作用、真皮血管增生等重要病理过程中起关键作用[18]。TNF可以促进人HaCaT和正常人表皮角质形成细胞（NHEK S）的促炎因子IL-6、CXCL 8和VEGF表达，还可以通过mTOR信号刺激皮肤炎症[19]。JUN是二聚体转录因子复合物AP-1的核心成员，对表皮生长因子受体（EGFR）表达有直接转录作用，角质形成细胞中AP-1的下调可诱发银屑病。JUN可作为表皮生长因子受体（EGFR）表达过程中角质形成细胞增殖/分化的正调节因子，从而起到治疗银屑病的作用[20]。Akt1可以促进亚型丝氨酸473磷酸化的上调，导致高浓度CCL 3通过K48键泛素化促进FOXP3降解，从而降低FOXP3的稳定性。CCL 3-mTORC2亚PKB/Akt1S473磷酸化轴在FOXP 3+Tregs中具有重要作用，能促进银屑病的发生发展[21]。Tp53对银屑病治疗的调节因子-1具有促凋亡功能，P53蛋白在细胞增殖调控中起着重要的作用[22-23]。

综上所述，本研究通过数据挖掘对中药治疗寻常型银屑病的处方进行分析与关联规则建模，从而得出生地黄-牡丹皮-甘草这一核心中药组合，并利用网络药理学方法推导了核心中药对寻常型银屑病的治疗靶点和作用机理。研究表明生地黄-牡丹皮-甘草可以通过槲皮素、山奈酚等类黄酮活性成分单体发挥诱导细胞凋亡、抗炎和抗氧化作用，通过STAT3、TNF等信号通路发挥对寻常型银屑病的治疗作用。最后，对最具活性生物化合物（槲皮素、山奈酚）与STAT3、TNF及JUN三项最具桥梁作用的靶点进行了分子对接模拟，对接结果表明2种活性化合物均与STAT3、TNF、JUN紧密结合，从而为其发挥药理作用提供了佐证，但仍需进行实验验证来进一步证实这一结论。