微管亲和调节激酶4的生理功能及其在心血管疾病中的研究进展

于莉莉，尚莎莎，周 阳，关怀敏，陈玉善

1 河南中医药大学，河南郑州 450000；2 河南中医药大学第一附属医院，河南郑州 450008

心血管疾病是全球范围内首要致死因素，虽然人类在预防和治疗心血管疾病方面取得了巨大的进步，但缺乏对其发生机制的全面了解仍是心血管疾病全球发病率和死亡率高居不下的主要原因[1]。受损的微管和线粒体是心肌细胞和内皮功能障碍发病的关键因素[2]。有研究者发现微管亲和调节激酶4(microtubule affinity-regulating kinase 4，MARK4)参与调节脂质代谢、炎症、细胞周期进展和增殖、胰岛素抵抗、氧化应激[3-4]，可导致心肌细胞和内皮细胞功能障碍，影响心血管功能。因此全面了解MARK4的生理功能和作用机制至关重要，可能是治疗心血管疾病的新思路。本文通过对MARK4的结构、生理功能及其与心血管疾病相关性进行综述，讨论一种新的心血管疾病干预靶点。

1 MARK4的生理功能

1.1 MARK4的结构和激活 MARK4是细胞微管相关蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(microtubule associated proteins，MAPs)家族的一员，由752个氨基酸残基组成，分子量约85 kU[5]。MARK4的酶核心是典型的“银杏叶”状折叠的催化结构域，沿着结构域表面延伸的接头序列通过疏水键与N末端的泛素结合结构域(ubiquitin-associated domains，UBA)相连，UBA通过间隔结构域与激酶结合基序1(kinase-associated domain 1，KA1)的C端相连。大部分的N端由β-链组成，只有1个α-螺旋(αC-螺旋)，而C端由6个α-螺旋和1个延伸的环组成，称为激活片段，αC-螺旋和活化片段是MARK4激酶核心最重要的部分[6]。MARK4在细胞中属于结构性激活，主要通过丝氨酸(serine，Ser)/苏氨酸(threonine，Thr)磷酸化实现。MARK4可以控制其底物进入活化环发生磷酸化而被激活，在Thr214磷酸化后，激活结构开始了一系列重排，形成保守且稳定的活性构象[7-8]。

1.2 MARK4与NLRP3炎症小体 MARK4与NLRP3在巨噬细胞中共表达，并以微管依赖的方式参与调节NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)炎症小体的定位和激活，NLRP3炎症小体的激活促进动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发展[9]。MARK4将NLRP3传递到微管组织中心，NLRP3在活细胞中沿微管转运，定位到特征斑点结构，形成特定的炎症体复合物，促进NLRP3炎症小体向线粒体募集并激活，通过Toll样受体和核转录因子κB(nuclear transcription factorκB，NF-κB)途径启动炎症因子[10-11]。除微管依赖机制外，MARK4还通过调节C-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase，JNK)信号通路触发NLRP3炎症体的激活[12-13]。MARK4和NLRP3在AS病变中的表达与活性，可能与白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18的产生有关[11]。因此，探索MARK4对NLRP3炎症小体的潜在机制对治疗AS等心血管疾病意义重大。

1.3 MARK4与氧化应激 研究发现，MARK4可以通过激活κB抑制蛋白激酶α(inhibitor kappa B kinase α，IKKα)/NF-κB信号通路促进线粒体氧化应激和脂肪炎症[3]。MARK4可以抑制细胞色素C(cytochrome C，CytC)的表达，通过增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的活性和降低抗氧化应激相关的谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性，降低膜电位和阻断呼吸链从而损害线粒体氧化呼吸[14]。随着炎症因子IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1的升高，MARK4的表达水平和ROS的活性进一步升高，加重氧化应激。大量研究表明NF-κB途径相关炎症在AS、心肌缺血再灌注损伤等心血管疾病中发挥重要作用，通过抑制MARK4减轻IKKα/NF-κB信号通路介导的氧化应激和炎症反应，这为心血管疾病分子机制的研究提供了新的思路。

1.4 MARK4与微管动力 MARK4的独特之处在于它对心肌细胞微管结构的调节能力。MARK4可以磷酸化并识别其底物MAPs(包括轴突微管稳定蛋白Tau、MAP2和MAP4)[15]。MARK4通过磷酸化MAP4，使人血管抑制蛋白(human vasohibin，VASH)进入微管，VASH2可与小分子血管抑制蛋白结合蛋白(small vasohibin binding protein，SVBP)结合形成复合物VASH2/SVBP，又称为微管蛋白酪氨酸羧肽酶(tyrosine carboxypeptidase，TCP)[16-17]。TCP使VASH2与α-微管蛋白的C端尾部相互作用时发生去酪氨酸修饰，使微管结构更紧密结合在心肌细胞的Z线上，限制心肌收缩[17-18]。总之，MARK4是通过磷酸化MAP4调节心肌细胞收缩力并控制VASH2对α-微管蛋白的去酪氨酸化来调节微管脱蛋白，导致MAP4在微管结构上的让位和脱落，使微管动力增加、细胞形状改变[19-20]。此外，VASH1缺失会增加心肌细胞收缩和舒张的速度[21]。MARK4在心脏中表达增加会抑制心脏正常发挥功能，而MARK4缺失可能对心肌细胞功能具有良好的改善效果，使其更易收缩和舒张，为心肌梗死和心力衰竭患者带来福音。MARK4特异性抑制剂的研发有望成为改善心肌收缩和舒张功能的新理念。

1.5 MARK4的其他功能 据报道，MARK4可以促进凋亡诱导因子与JNKs结合，激活JNKs/c-Jun信号通路，JNK1及激活蛋白1的磷酸化水平上调，阻断抗凋亡基因的表达，磷酸化相关凋亡蛋白，导致线粒体功能障碍，促进细胞凋亡[22]。研究发现抑制JNK可减少心肌细胞的凋亡[22-23]，结合上述MARK4对细胞凋亡的调控作用，通过抑制MARK4抑制JNKs/c-Jun信号通路，可能是治疗心肌细胞疾病的一种新方法。另外，Mark4缺失(Mark4-/-)小鼠的脂肪质量含量、血液三酰甘油和胆固醇水平显著降低，这些指标可通过其促炎和促凋亡特性诱导细胞线粒体功能障碍[5]。MARK4还可通过激活JNK1和抑制p38丝裂原活化蛋白激酶通路促进脂质沉积和脂滴集聚[24]，脂质沉积学说与高血压、AS等心血管疾病的发生发展息息相关，通过抑制MARK4从而抑制脂质积累可能是治疗心血管疾病的新型药物靶标。此外，Yang等[25]发现当细胞面临“饥饿”或缺乏氨基酸时，MARK4可使单磷酸腺苷激活蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate [AMP]-activated protein kinase，AMPK)磷酸化，但抑制蛋白激酶B(protein kinase B，PKB；又称AKT)磷酸化水平，通过激活AMPK途径和抑制AKT/mTOR通路，可使mTOR复合物1(mTOR complex 1，mTORC1)从溶酶体中解离，促进血清饥饿诱导自噬[26-27]。自噬失调也与心血管疾病的发生发展密切相关，进一步挖掘MARK4调节自噬的心功能，将成为防治心血管疾病的潜在策略。虽然发现MARK4在参与体内脂肪生成、细胞凋亡和自噬等相关过程，但现阶段对MARK4在亚细胞定位和调控蛋白水平方面的了解仍然欠缺，探索其生理功能意义重大。对MARK4的全面了解会为防治心血管疾病指引新方向。

2 MARK4与心血管疾病

2.1 MARK4与动脉粥样硬化 Clement等[11]为了评估MARK4在NLRP3炎症体激活和AS形成中的作用，将低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)缺失的小鼠进行致命性辐射并用野生型和Mark4-/-小鼠骨髓细胞重建，给予高脂饮食9周后，发现Mark4-/-使粥样斑块显著减小，斑块泡沫细胞中IL-18和干扰素-γ(interferon γ，INF-γ)水平降低。此外，原代小鼠骨髓来源的巨噬细胞中Mark4-/-可阻止NLRP3炎症体的激活，抑制Caspase1的激活并减少IL-1β和IL-18的产生，参与不稳定斑块形成[28]，而MARK4与NLRP3在巨噬细胞中共表达，IL-1β和IL-18在AS巨噬细胞中高度表达，因此MARK4也促进AS斑块的发展[29]。综上，当MARK4高表达时，可激活NLRP3炎症小体，通过上调INF-γ、IL-1β和IL-18在巨噬细胞中的表达水平，参与内皮炎症和不稳定斑块的形成过程，促进AS。而MARK4被抑制时，不稳定斑块的形成过程减缓或消失，这充分说明了MARK4在AS发生发展中的重要性。因此，把MARK4作为治疗靶点，寻找其抑制剂阻断NLRP3炎症小体激活，将会成为限制AS和心血管并发症发生的新理念，具有重要的医学价值和科学意义。

2.2 MARK4与心肌缺血再灌注损伤 在一定时间内解除冠脉梗阻，心肌血流恢复灌注后出现心肌损害、能量代谢和心电功能障碍加重的病理现象，称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[30-31]。MARK4过表达可促进MIRI时缺氧/复氧刺激下ROS的产生和K+外流，激活NLRP3炎症小体[32]。使线粒体损伤、促凋亡蛋白释放、炎症细胞浸润，促进炎症因子和趋化因子的释放，导致血管内皮功能障碍[33-34]。所以阻断炎症反应，靶向调节MARK4可能是保护血管内皮的有效方法。MARK4可与过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPARγ)相互作用，抑制氧化应激和炎症反应[3]。炎症反应和氧化应激在MIRI过程中起关键作用，其炎症因子水平与MIRI病情严重程度密切相关。基于抑制NLRP3炎症体激活和促进PPARγ激活的治疗策略研发MARK4抑制剂是改善MIRI和保护心脏的新途径。

2.3 MARK4与缺血性心力衰竭 Yu等[35]为了评估MARK4在缺血性心脏病中的作用，使用左前降支冠状动脉结扎(ligation of left anterior descending coronary artery，LAD)的小鼠模型，诱导大范围心肌梗死。使用心肌细胞特异性敲除Mark4小鼠，发现Mark4-/-小鼠的左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)与第1天的同窝对照组小鼠相比，提高了56.8%(P＜0.05)，差异有统计学意义，说明Mark4-/-在心肌梗死后的心功能调节中具有保护作用。接着从野生型小鼠和Mark4-/-的小鼠中分离出原代心肌细胞，进行单细胞收缩实验，野生型小鼠心肌梗死后心肌细胞收缩减少、舒张速度较慢；而进行LAD手术的Mark4-/-小鼠则具有相反效应，表明Mark4-/-改善心肌梗死后心肌细胞的收缩和舒张功能。MARK4调节缺血性心脏病中的微管去酪氨酸化，是调节心肌细胞收缩舒张的重要机制。微管化干扰心脏衰竭时心肌细胞的收缩功能，MARK4通过靶向控制缺血心脏中微管的去纤维化改变心肌细胞收缩力以改善心脏功能[36]。但Mark4-/-对心梗后心功能的保护作用有无不良反应、是否能够长期保持尚未可知，抑制MARK4能否改善非缺血性心力衰竭的心肌收缩功能需进一步探究。

3 MARK4在心血管疾病中的潜在抑制剂

MARK4具有结构和化学多样性，研究者通过高通量筛选或基于结构的药物设计来辨别具有结合亲和力的分子，找到潜在靶标。现已发现一些化合物和抑制因子具有抗氧化和抗炎活性，其潜在抑制剂已被用作药物发现的先导。

Parveen等[37]通过光介导的氧化偶联反应使用2杂芳基色酮和苯胺形成碳-氮键合成新的3-N-芳基取代-2-杂芳基色酮，它可诱导细胞凋亡和降低Tau磷酸化，对MARK4表现出优异的体外抑制作用。Manea等[38]和Sun等[39]证明了组蛋白去乙酰化酶抑制剂亚过氧基苯胺羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)通过下调MARK4表达抑制NF-κB介导的氧化应激和炎症反应，表明SAHA是MARK4/NF-κB信号通路的上游抑制剂。研究发现PPARγ是MARK4的一种新的转录抑制因子，它通过与MARK4启动子区结合阻断氧化应激和炎症[3]。首次证实SET8抑制MARK4/NLRP3炎症体通路的激活，泛素特异性肽酶17样家族成员通过稳定SET8蛋白防止细胞衰老[40]。随着对MARK4的研究，其潜在抑制剂不断被发现，它们在癌症、神经退行性变和代谢性疾病的治疗中效果显著，在心血管疾病中也发挥一定效果，但在心血管疾病中并不具有特异性和高效性。即便开发小分子MARK4抑制剂的研究陆续出现，但由于不良的效力和选择性，临床上尚未发现治疗心血管疾病的特异性抑制剂。全面了解MARK4将会给心血管疾病的防治带来新希望。

4 结语

目前，对于MARK4生理功能和作用机制的研究较为局限，多集中于炎症层面，其抑制剂的研究也处于起步阶段，多聚集于阻断炎症激活，从其他机制切入的研究基本为零，探索其他层面机制可拓宽心血管疾病治疗靶点的范围。MARK4微管动力学新机制的发现具有里程碑意义，为研究改善心肌细胞收缩和舒张力的新型药物提供合理出发点，为治疗心血管疾病提供新方向。目前发现的MARK4相关选择性抑制物尚未在人体内得到验证，其对心血管疾病的治疗效果和敏感度仍未知，需要进一步大规模试验来验证其功效。MARK4在心血管疾病中的特异性抑制剂尚未发现，以抑制MARK4过表达为研究中心的治疗模式会成为一个独特的发展趋势，探索MARK4的靶基因及其调控方式，特异性MARK4抑制剂的开发将在心血管疾病的研究中开辟新领域。综上所述，我们可以更深层地挖掘MARK4在心血管疾病中潜在作用机制，MARK4有望成为心血管疾病防治的一个潜在药物靶点。