美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒的HPLC特征图谱相似性研究

张 悦 高 晗 吴清雨 李军山,3,4 王亚涛 曾永祯 董博宇 张睿智 孙福仁*

1.北京市平谷区市场监督管理局检验检测中心，北京 101200；2.神威药业集团有限公司,河北 石家庄 051430；3.楚雄神威施普瑞药物研究有限公司,云南 楚雄 675000;4.云南省中药配方颗粒工程研究中心,云南 楚雄 675000

美洲大蠊为蜚蠊科昆虫美洲蜚蠊Periplanetaamericana(Linnaeus) 的干燥全体。夏季捕捉或人工饲养。本品咸，寒。入心、肝、脾、肾经。可健脾消疳、活血通脉、利水消肿、敛疮生肌。用于胁痛、癥瘕、疳积、心悸、气喘、水肿。外用治水火烫伤、各种创伤及溃疡[1]。分布广泛，全国各地均有[2]。已知的化学成分主要有蛋白质、脂肪酸、核酸、多糖、信息素、昆虫神经肽、异黄酮、表皮生长因子等[3-7]。

美洲大蠊药材中已分离鉴定出含有肌苷、腺苷、尿嘧啶、次黄嘌呤等嘌呤类成分[8]，并建立相应的含量测定方法[9]。美洲大蠊因其具有显著的组织修复、抗肿瘤、增强免疫力等功效，已被加工制备成多种剂型[10]，如美洲大蠊提取物、配方颗粒等。有研究[11]对美洲大蠊提取物C11-3指纹图谱分析，确定11批提取物共有峰为21个，相似度大于0.90。美洲大蠊配方颗粒特征图谱中呈现7个特征峰，以尿嘧啶、酪氨酸、次黄嘌呤、肌苷对照品标定了7个特征峰中的4个[12]。尚未有美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒相似性研究报道，因此，本文依托HPLC色谱法，以美洲大蠊中嘌呤类成分为分析对象，建立了美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒特征图谱，并通过相似度考察进行相似性评价，为美洲大蠊配方颗粒质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 WATERS Symmetry Shield C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；岛津高效液相色谱仪(LC-20AT泵，SPD-M20A型检测器，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，岛津LabSolutions色谱工作站)；CPA225D型电子分析天平(北京赛多利斯)；JM-A5002型电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司)；KH-7200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；R502B旋转蒸发仪(上海申科生物技术有限公司)；LGJ-12压盖型真空冷冻干燥机(河南兄弟仪器设备有限公司)；荣事达养生药膳壶(合肥荣事达小家电有限公司)；0.45μm有机系/水系针头式滤器(ASC，AMERICAN SCIENTIFIC)。

1.2 对照品 尿嘧啶(批号：T14A8X33880，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；尿苷(批号：110887-202104，纯度99.6%，中国食品药品检定研究院)；鸟苷(货号：B20905，纯度≥98.0%，上海源叶生物科技有限公司)；次黄嘌呤(批号：DST200305，纯度≥98%，乐美天医药/德思特生物)；肌苷(批号：140669-202007，纯度99.2%，中国食品药品检定研究院)；腺苷(批号：AF20122001，纯度≥98%，成都埃法生物科技有限公司)。甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)均为HPLC级(美国ACS公司)；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。

1.3 药材、标准汤剂、中间体与配方颗粒

1.3.1 药材 10批美洲大蠊饮片来源于云南、四川、安徽、山东4个产区，经原河北省药品检验所孙宝惠老师鉴定，均为蜚蠊科昆虫美洲蜚蠊Periplanetaamericana(Linnaeus) 的干燥全体。

1.3.2 标准汤剂 根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》中相关规定，确定美洲大蠊标准汤剂制备工艺为：取饮片100 g，加水煎煮两次。一煎加8倍水，浸泡30 min，煮沸，保持微沸煎煮30 min，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加6倍水，煮沸，保持微沸煎煮20 min，200目筛网过滤，合并两次煎液，立即冷却至室温，低温真空浓缩，浓缩液冷冻干燥，密封包装，即得。

1.3.3 中间体、配方颗粒 依据标准汤剂含量、出膏率、特征图谱要求，优化提取参数，确定美洲大蠊配方颗粒制备方法为：取美洲大蠊药材，切碎，加水煎煮2次，第一次加入10倍量水，煎煮30 min，过滤；第二次向药渣中加入8倍量水，煎煮20 min，过滤；合并两次滤液，控制浓缩温度为55～70 ℃，真空度为0.06～0.09 MPa之间，浓缩至相对密度为1.03～1.05(60℃)，浓缩液喷雾干燥，控制进风温度为160～180 ℃，出风温度为80～100 ℃，及时收集干膏粉，即为美洲大蠊配方颗粒中间体，向中间体中加入糊精，补足处方量，混合均匀，干法制粒，制成美洲大蠊配方颗粒。

2 方法与结果

2.1 美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒特征图谱建立

2.1.1 色谱条件 WATERS Symmetry Shield C18(柱长为250 mm，内径为4.6 mm，粒径为5.0 μm)；以0.25%冰醋酸水为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温：20 ℃；流速：0.6 mL/min；检测波长为254 nm。理论板数按肌苷峰计算应不低于5000。

时间/minA/%B/%0～9100→1000→09～10100→980→210～1598→972→315～3597→963→435～6096→884→12

2.1.2 对照品溶液的制备 取尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷对照品，加水制成每 1 mL含尿嘧啶20 μg、次黄嘌呤30μg、尿苷20 μg、腺苷10 μg、肌苷45 μg、鸟苷15 μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

2.1.3.1 美洲大蠊饮片供试品制备 取本品粉末(过二号筛)约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25 mL(V/V)，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀过滤，滤过，即得[9]。

2.1.3.2 美洲大蠊标准汤剂、中间体、配方颗粒供试品制备 取本品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25 mL(V/V)，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度 取同一批次美洲大蠊标准汤剂，按2.1.3.2项下供试品制备方法处理，按2.2.1项下连续进样6次。以肌苷峰为参照物，经计算12个特征峰相对保留时间的RSD 值为0.00%～0.23%，相对峰面积的RSD值为0.00%～1.02%，表明仪器精密度良好。

2.2.2 稳定性 取同一批次美洲大蠊标准汤剂，按2.1.3.2项下处理，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h时按2.2.1项下进样，以肌苷峰为参照物，经计算12个特征峰的相对保留时间的RSD 值为0.00%～0.22%，相对峰面积的RSD 值为0.00%～0.94%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.3 重复性 取同一批次美洲大蠊标准汤剂6份，按2.1.3.2项下处理，按2.1.1项下依次进样检测。以肌苷峰为参照，经计算共有峰的相对保留时间的RSD 值为0.00%～0.28%，相对峰面积的RSD 值为0.00%～2.32%，表明方法的重复性良好。

2.3 样品测定 取10批美洲大蠊饮片、美洲大蠊标准汤剂、美洲大蠊中间体、美洲大蠊配方颗粒供试品溶液，按2.1.1项下进行检测，色谱图如图1～4所示。

时间/min图1 美洲大蠊饮片特征图谱

时间/min图2 美洲大蠊标准汤剂特征图谱

2.4 特征峰指认 将采集到的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)选择平均数法、生成对照指纹图谱。通过与对照品保留时间及文献资料比对，确定了标准汤剂特征图谱中3号峰为尿嘧啶，4号峰为次黄嘌呤，6号峰为尿苷，8号峰为腺苷，9号峰为肌苷，10号峰为鸟苷。如图5所示。

时间/min图3 美洲大蠊中间体特征图谱

时间/min图4 美洲大蠊配方颗粒特征图谱

时间/minS1：美洲大蠊标准汤剂；S2：尿嘧啶；S3：次黄嘌呤；S4：尿苷；S5：腺苷；S6：肌苷；S7：鸟苷图5 美洲大蠊标准汤剂图谱特征峰指认图

2.5 相似性分析 将美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒HPLC对照图谱进行直观比较如图6所示，并导入相似度评价软件计算相似度。见表1。同时，将10批美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒HPLC图谱导入软件并计算相似度。见表2。结果表明12个特征成分在美洲大蠊饮片制备成标准汤剂、中间体、配方颗粒的过程中得到保留，其中6个成分为尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷。且通过相似度计算，美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒对照图谱相似度在0.90～1.00之间；10批配方颗粒与10批美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体相似度均在0.90～1.00之间。表明美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒有较好的相似性。

3 讨论

3.1 色谱柱考察 本文侧重分析了美洲大蠊中水溶性较强的嘌呤类成分，该类成分在常规十八烷基键合硅胶色谱柱上分析效果较差。通过筛选，确定了WATERS Symmetry Shield C18色谱柱，该色谱柱可以兼容100%水相系统，同时，极性键合基团能够起到对极性物质的保留作用。故确定使用WATERS Symmetry Shield C18色谱柱。

时间/min

表1 美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒对照图谱相似度计算结果

表2 饮片、标准汤剂、中间体及配方颗粒图谱相似度计算结果

3.2 流动相考察 在流动相选择上，考察了不同浓度的乙酸水溶液，发现采用0.25%的乙酸水溶液时，特征峰4、5分离度得到改善，高于此浓度时，分离度没有明显改善，浓度低于0.25%时，峰4、5分离度较差，确定0.25%乙酸水为水相。通过比较甲醇、乙腈时，甲醇极性更大，更适合水溶性较好的嘌呤类成分，因此，选择甲醇为有机相。

3.3 柱温考察 分别设定柱温为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，经考察发现，柱温越低，特征峰4、特征峰5分离度越大，以20 ℃柱温时，特征峰4、特征峰5分离度达到1.5以上，因此，选择柱温为20 ℃较为适宜。

3.4 检测波长 通过样品中特征峰全波长扫描波长，发现设定254 nm时，各色谱峰数量、分离度均较好，反映出美洲大蠊嘌呤类成分的多样性，所以确定254 nm为检测波长。

3.5 供试品制备方法考察 本文按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(送审稿)》中相关要求，以美洲大蠊饮片制备了10批美洲大蠊标准汤剂、美洲大蠊中间体膏粉、美洲大蠊配方颗粒。查阅参考文献资料，结合标准汤剂、配方颗粒均为水提取，确定美洲大蠊饮片提取溶媒为水[9]；美洲大蠊标准汤剂、中间体、配方颗粒是美洲大蠊饮片经以水溶媒提取、浓缩、制剂而成，通过水、30%、50%、70%甲醇为溶媒进行检测、比较，以水为提取溶媒时，特征峰面积较大，分离度较好，故确定以水为提取溶媒。超声处理与回流提取考察，结果显示超声提取能够更好体现美洲大蠊中嘌呤类成分，故选择超声提取法。

研究通过美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒的HPLC图谱相似性研究，在化学成分上解释了12个特征峰在美洲大蠊饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒存在相似性，为美洲大蠊配方颗粒质量控制提供数据参考。