假丝酵母菌ERG11 和ERG3 基因突变与氟康唑耐药的研究

王彦 马芬芬 梁伟 王琨 刘霞 杨伏猛 王西珍

医疗水平的提升在很大的上延长了部分严重疾病患者的生存年限,但也增加了真菌感染性疾病发生的几率。既往有资料记载［1］,侵袭性真菌感染者的死亡率高达50%,虽然部分抗真菌药物对真菌感染的进程能起到一定控制作用,但伴随真菌对其产生耐药性及标准化抗真菌治疗未取得显著疗效,临床治疗难度相应增加,越来越多的人投身到真菌的耐药机制研究中。本文主要研究热带假丝酵母菌、白色假丝酵母菌可能的耐药机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源 选取2019 年1 月～2020 年6 月入住本院治疗的100 例真菌培养阳性者,ATCC 90029 白色假丝酵母菌、ATCC 750 热带假丝酵母菌、ATCC 6258克柔假丝酵母菌作为标准质控菌株。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂 DNA提取试剂盒,PCR试剂盒,PCR 引物及扩增仪、离心机及成像系统等。

1.2.2 菌株鉴定和体外药敏试验 对菌株采用分离、纯化处理,初步筛选菌株。针对采集的菌株纯化以后进行接种,恒温孵育48 h,提取呈白、绿、蓝、紫及红色的酵母样菌落作试样；获取DNA 后扩增、测序初筛后的菌株,完整标准化的分子生物学鉴定。利用专业软件校正测序峰图与基因序列(ITS1 区、D 区)。检测采集到的100 株假丝酵母菌菌株的MIC,并进行体外药物敏感性试验,每次均选标准株作为质控菌株,其MIC值处于M27～S4 设定的区间中,就判读对应的试验操作有效。本次试验获得耐氟康唑的热带假丝酵母菌5 株、白色假丝酵母菌9 株。

1.2.3 提取假丝酵母菌DNA 严格依照基因抽提试剂盒说明书进行操作,提取以上分离株的基因组DNA。

1.2.4 基因扩增 分别把基因文库登录号AY856352与M23673 作为已知序列设定2 对引物,分别设置白色假丝酵母菌ERG3 引物序列和热带假丝酵母菌引物序列。PCR 扩增反应的主要参数：第Ⅰ阶段：95℃条件下持续预变性5 min；第Ⅱ阶段：内变性95℃ 30 s、退火55℃ 30 s、延伸70℃ 1 min,共计进行38次循环；第Ⅲ阶段：70℃终延伸9 min,低温(4℃)保存。PCR反应体系体积50 μl,包括forward primer 2 μl,reverse primer 2 μl,PCR master mix 25 ml,蒸馏水20 ml,DNA模版2 μl。PCR 扩增产物,EB 染色,凝胶成像下摄像。

1.2.5 产物纯化及测序分析 委托权威机构对PCR产物进行双向测序。

1.3 观察指标 比较分析PCR 产物和GenBank 数据库外供的基因序列,进而探寻到基因突变点。

2 结果

2.1 菌株鉴定和药敏试验情况 ITS1 扩增后形成了片段规格类似的条带,在500～620 bp范围中。鉴定发现,分离到的100 株假丝酵母菌内,其中热带假丝酵母菌、白色假丝酵母菌占真菌总数的65%,分别有15 株和50 株。其中9 株白色假丝酵母菌株的氟康唑24 h MIC＞16 mg/L,确定其是耐药菌株；5 株热带假丝酵母菌对氟康唑和伏立康唑双重耐药。

2.2 PCR 扩增情况 PCR 对临床分离获得的14 株假丝酵母菌进行扩增,都获得了预期产物,规格和DNA Marker 相比较,部位吻合,未形成非特异性产物带。

2.3 基因测序情况 基于Blast 比较热带假丝酵母菌和白色假丝酵母菌的测序结果,将起始密码子ATG的A 计数设定成1,基于此探寻到突变基因。5 株热带假丝酵母菌ERG11 基因存有同义、错义突变分别为5、4 个,错义突变分别是Y132H、G487T、A530C、G533C；ERG3 基因依次有7 个和12 个；白色假丝酵母菌ERG11 和ERG3 基因各发现4 个同义突变,前者有3 个错义突变,后者为0。分析 ERG11 基因序列以后,发现其在氟康唑敏感菌株仅是发生了单个突变,康唑剂量自身依赖敏感程度和耐药菌株内ERG11 基因突变以多位点错义突变同时出现为主。

3 讨论

既往有文献报道,痰液、阴道、大便和腹水内白假丝酵母菌的检出率相对较高,占比依次为76.1%、68.2%、63.7%和 60.0%,但是在血液与尿液内所占比例并不高,分别为31.8%和47.3%,热带假丝酵母菌在尿液内的检出比例达到了12.4%,但是在痰液道、大便血液内的占比均不到7.0%。有文献资料记载,在1997～1998年之间热带念珠菌的检出率是4.6%,1999 年升至5.3%,2001～2003 年时这一指标的检出值已经上升至7.4%。假丝酵母菌是临床上发生率较高的一种真菌感染性疾病,免疫力正常的群体内以皮肤黏膜感染维主要表现,而在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者、肿瘤化疗者等免疫力偏低群体中经常表现为深部真菌感染或全身性的播撒式感染,并且感染经常屡次发作久治不愈。多烯类、唑类、吗啡类等均是当下临床常用的抗真菌类药物［2］。唑类药物特别是氟康唑有生物利用度高、组织穿透力强、半衰期长及疗效显著等优势,从20世纪80年代以来,成为了防治假丝酵母菌感染的一线药物。但规模化使用抗真菌药物加快了药物耐药进程。

假丝酵母菌产生耐药性的原因十分复杂,其耐药机制主要和基因突变及过度表达、细胞壁组分变性与生物被膜产生等存在相关性。但既往已有研究证实,单个靶酶基因突变就会导致白假丝酵母菌对氟康唑的敏感性降低［3］。ERG11 基因也被叫做ERG16 或者CYP51A1 基因,其编码蛋白为氮唑类药物作用的靶酶,即羊毛固醇14-去甲基化酶(14-DM),该类酶是一种细胞色素P-450 酶,由528 个氨基酸构成,参与真菌细胞膜麦角固醇的合成过程,在维持细胞膜结构与功能常态化方面发挥着重要作用。ERG11 基因突变可能会引起参与编码的氨基酸改变,Erg11P 结构随之变化,进而作用于酶和药物的亲和过程,形成耐药。既往有研究发现,ERG11 编码的14-去甲基化酶为合成麦角固醇生物过程中的一种必需中间合成酶,唑类抗真菌药能够和本酶活性位点上的血红蛋白结合,对真菌麦角固醇生物合成阶段的关键酶活性能形成一定抑制作用,降低麦角固醇的合成效率,对真菌质膜的完整性造成不同程度的损伤,进而发挥抑制真菌生长、繁殖过程的作用。在本课题研究中,发现5 株热带假丝酵母菌ERG11 基因存有同义、错义突变分别为5、4 个,错义突变分别是Y132H、G487T、A530C、G533C,并且意外的发现错义突变和多点位多变同时出现,本文报道出的突变位点都是已经位点,没有探查到新突变。乔祖莎等［3］研究、总结了43 株假丝酵母菌体外药敏实验情况,发现氟康唑耐药率达55.8%,RT-PCR 研究后发现ERG11 基因mRNA 呈现出高表达特征,PCR 对ERG11 基因测序过程中发现5 个基因出现了错义突变情况,其中Y132H 基因和本文报道结果相一致。

细胞色素P-450 羊毛甾醇-14α-去甲基化酶为唑类化合物的主要作用靶点,通过结合羊毛甾醇-14α-去甲基化酶活性位点上的血红蛋白,对羊毛甾醇-14α-去甲基化酶催化合成麦角甾醇的过程形成一定抑制作用,进而对真菌细胞膜造成损伤,对真菌正常生长、繁殖过程形成抑制作用。氟康唑靶酶编码基因ERG11 突变与高表达是形成耐药性的主因,也是国内外领域中研究的热点问题之一。当下,国内很多学者针对酵母菌对唑类药物产生的耐药机制进行了大量研究,普遍认为主要和如下几点相关：①唑类药物作用的靶酶部分编码基因突变,诱导编码的氨基酸发生变化,进而影响酶和药物之间的亲和程度,形成耐药性；②靶酶基由于表达过度生成了大量的靶酶,造成细胞中血药浓度不能像初始那样对酶生物活性形成抑制作用,这也是引起耐药问题的主要原因之一；③外排泵出现不同程度的改变：ABCT 与MF 均是常见的外排泵基因,分别属于ACB 转运蛋白家族、易化扩散载体超家族,如果它们过度表达,则会导致细胞中药物积累量降低,形成耐药性。

本实验研究中采集的100 株致病假丝酵母菌中,热带假丝酵母菌、白色假丝酵母菌分别有15株和50株,占真菌总数的65%［4］。分析各自占比不难发现伴随假丝酵母菌病流行病学的改变,和过往报道相比较,非白色假丝酵母菌致病率有提高趋势。比较经双向测序获得结果和标准菌株,白色假丝酵母菌ERG3 基因上未见新的突变点,ERG11 基因上存有T485A 与C795T两个同义突变点［5］；而在热带假丝酵母菌ERG11 基因内新发现了C639T 同义突变点,其没有引起氨基酸发生变化,ERG11 基因上存有同义、错义突变分别有5、4 个［6］。鉴于白色假丝酵母菌样本量过少的实况,ERG11 基因也成为众多医学者研究的重点,未见新的错义突变位点,和既往研究报道结果相一致［7,8］。近期有学者在研究中指出,药物敏感株和耐药株两者的形成同义位点的突变情况也可能会存在一定差异,对基因的表达程度基本不会形成明显影响,可以联合进行mRAN 检测,进而更好的探究突变位点与耐药两者的相关性。

综上所述,假丝酵母菌ERG11、ERG3 均存在程度不一的突变,其可能参与假丝酵母菌耐药性形成过程。在后续研究中,为进一步检验基因突变与氟康唑耐药性形成之间的关系,还需借助定点突变法进行,由功能性表达方面着手,探明假丝酵母菌的耐药机制,为临床合理安全选用抗真菌药物提供更可靠的依据。