褐藻胶裂解酶AlyE2酶学性质研究❋

郑 智, 张红秀, 刘伟治, 律倩倩

(中国海洋大学海洋生命学院， 山东 青岛 266003)

褐藻胶是褐藻中含量最多的多聚糖，约占其干质量的40%[1]，是由古罗糖醛酸(α-L-guluronate，G)及其C5的差向异构体甘露糖醛酸(β-D-mannuronate，M)通过β-1，4糖苷键连接成的线性分子。根据单糖分子的排布，褐藻胶被分为三种结构形式：多聚古罗糖醛酸(polyG)、多聚甘露糖醛酸(polyM)和M/G交替排列的polyMG。褐藻胶的降解产物为褐藻寡糖，并且不同聚合度(Degree of polymerization，DP)的褐藻寡糖具有不同的功能，在医药、食品等领域具有广阔的应用前景。例如，来源于Pseudoalteromonassp. Strain No.272的褐藻胶裂解酶通过降解polyM和polyG产生的聚合度为4的褐藻寡糖来促进细胞产生细胞毒性因子，从而抑制人白血病 U937 细胞的生长[2]；由Microbulbifersp. ALW1分离的褐藻胶裂解酶，降解褐藻胶产生的聚合度为2～3的寡糖具有清除自由基的能力[3]；聚合度为2～7的褐藻寡糖可以延缓草莓中脱落酸的释放，从而使草莓贮藏时间延长[4]等。褐藻胶裂解酶可以通过β-消除反应将褐藻胶降解成寡糖和单糖[5-6]，在CAZy数据库(Carbohydrate-Active Enzymes Database)分类中，褐藻胶裂解酶主要分布在PL5、PL6、PL7、PL8、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36、PL39和PL41共14个褐藻胶裂解酶家族(Polysaccharide lyase family，PL)中，并且已报道了多个褐藻胶裂解酶结构，主要包括4种不同的结构形式：(α/α)n桶、β果冻卷、β折叠片和(α/α)n桶+β果冻卷的双结构域形式。

本实验室在前期研究中发现了一株可利用褐藻胶的菌株(Vibrioalginolyticus)，通过全基因组测序发现该菌株有多种褐藻胶裂解酶基因。本研究对其中的alye2基因进行了克隆，并利用E.coilBL21(DE3)对其进行了重组表达，经过镍柱纯化获得了重组蛋白AlyE2，研究了AlyE2的底物偏好性及在不同pH、温度和NaCl浓度的活性，并探究了NaCl浓度对AlyE2热稳定性的影响。

1 材料方法

1.1 实验材料

可利用褐藻胶的菌株Vibrioalginolyticus保存于本实验室，质粒载体pET32a和E.coilBL21(DE3)感受态细胞保存于本实验室。引物合成和测序委托生工生物有限公司。PrimeSTAR HS DNA Polymerase，EcoRⅠ和XhoⅠ及T4连接酶购于Takara。Bacterial DNA Kit和Cycle Pure Kit购于OMEGE。褐藻胶购自上海源叶生物科技有限公司，polyM和polyG按文献[7]方法制备，将褐藻胶在高温下酸解，加入NaHCO3，使用盐酸调节pH至中性，高速离心得到沉淀和上清，并分别使用Na2CO3处理，使溶液pH 达到7.0，乙醇沉淀后沉淀即为polyG和polyM。其他常用生化试剂采购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 AlyE2的序列分析 通过在线软件SMART分析蛋白的信号肽与结构域[8]；通过ProtParam tool预测蛋白分子量和等电点等性质[9]；通过NCBI在线工具BLASTP对AlyE2的相似蛋白进行检索；检索 CAZy数据库得到PL7家族褐藻胶裂解酶序列，利用本地软件MEGAX[10]进行多序列比对，并使用ESPrit 3.0在线软件[11]对多序列比对结果进行展示。使用MEGAX采用邻接法(Neighbor-Joining method)，设置Bootstrap为1 000次，建立进化树确定酶的分类。

1.2.2 AlyE2的表达载体构建 根据基因序列对去除信号肽的基因片段设计并合成PCR引物，引物序列如下F：gctgatatcggatccgaattcTCAAATATCAATGTTG GTCAACAATT；R： gtggtggtggtggtgctcgagTTATTGATTGAGAATTAACTGGTAGAAGC，下划线分别代表：EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位点。利用Bacterial DNA Kit提取V.alginolyticus的基因组，以基因组作为模板，按以下反应体系：dNTP mix 4 μL，5×Primer Buffer 10 μL，正反向引物各 1.5 μL(10 μmol/L)，基因组20 ng，加入ddH2O至50 μL体系。PCR反应条件为：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性5 s；55 ℃退火10 s；72 ℃延伸1.5 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。按以上反应条件反应得到目的序列，双酶切后连接至pET32a载体，转化至E.coilBL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆进行测序。

1.2.3 AlyE2的表达与纯化 将种子液按1%(v/v)接种于1 L的含有100 μg/mL氨苄青霉素LB培养基中，37 ℃培养1 h 40 min，至菌液OD600为0.4～0.6时，加入终浓度为0.2 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)，转移至16 ℃过夜培养。离心收集菌体，加入结合缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑)重悬菌体，超声功率300 W，工作/停止间隙为2 s/4 s，共持续25 min，高速离心后收集上清。使用Ni-NTA琼脂糖重力柱结合目的蛋白，使用结合缓冲液充分清洗后，加入10 mL缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5，500 mmol/L NaCl)，加入0.1 mg PreScission蛋白酶[12]，柱上酶切3 h，收集流出作为粗酶。利用考马斯亮蓝法确定蛋白浓度，标准品为牛血清蛋白，利用SDS-PAGE电泳检测蛋白表达和纯化情况。

1.2.4 酶活力测定与酶学性质检测

1.2.4.1 酶活力测定 采用OD235法测定反应体系中不饱和双键来确定酶活。按如下反应体系反应：0.2%(m/v)褐藻胶，20 mmol/L pH为7.5的磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4，PB)，1.0 mol/L NaCl，反应温度30 ℃，反应时间10 min，每组反应设置3个平行，测定OD235的变化值，将每分钟内OD235增加0.1定义为1个酶活力单位(U)。

1.2.4.2 底物特异性与酶解产物分析 为研究AlyE2的底物特异性，分别检测AlyE2降解polyM、polyG和褐藻胶反应体系在235 nm下的吸光值的变化。通过薄层色谱层析(TLC)检测酶解过程的产物分布[13]，分别取1、3、10、30、60 min的样品，100 ℃灭活5 min，12 000g离心1 min，取2.5 μL反应后产物点样于硅胶板(生产商：Merck，默克)，用展开剂(正丁醇∶甲酸∶水=4∶6∶1，v/v/v)展开样品，结束后吹干硅胶板，喷洒显色剂(二苯胺2 g，苯胺2 mL，丙酮100 mL，磷酸10 mL，浓盐酸1 mL)并在高温下显色。

1.2.4.3 NaCl浓度、金属离子及有机试剂对酶的活力影响 测定NaCl浓度对AlyE2酶活的影响时，将反应体系中NaCl的浓度调整为0～3.0 mol/L；测定金属离子对AlyE2酶活的影响时，将AlyE2分别与1 mmol/L的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+、K+、Ca2+和Ni2+溶液混合，在4 ℃孵育1 h；测定有机试剂对AlyE2酶活的影响，将乙醇、异丙醇、正丁醇和甲苯按10%(v/v)的比例 加入反应体系中。上述反应体系，按1.2.4.1中方法来测定AlyE2的活力。

1.2.4.4 最适温度和最适pH 为检测AlyE2的最适温度，按1.2.4.1中方法，分别在20、25、30、37、40、50和60 ℃测定酶活力。为检测AlyE2的最适pH，使用的20 mmol/L的pH 缓冲液(pH为5.0～6.0的Na-Acetate buffer、pH为6.0～7.5的Na-Phosphate buffer、pH为7.5～8.0的Tris-HCl buffer、pH为8.0～9.0的Bicine-NaOH buffer、pH为9.0～11.0的Glycine-NaOH buffer)，按1.2.4.1中方法测定酶活。

1.2.4.5 动力学参数确定 按照1.2.4.1中方法检测在不同浓度底物条件下AlyE2的反应速率[14]，测试的底物为0.4～4.0 mg/mL的褐藻胶，测定反应1 min内的反应速率。利用数据处理软件OriginPro拟合米氏曲线计算动力学参数，使用消光系数ε=6 150 mol-1·L·cm-1[15]计算最大反应速度Vmax。

1.2.4.6 NaCl浓度与蛋白热稳定性的关系 将AlyE2分别透析至含有0、0.5、1.0、2.0和3.0 mol/L NaCl的20 mmol/L PB溶液中，将不同缓冲液中的蛋白浓度均调整至1 mg/mL。利用差示扫描微量热仪(MicroCal PEAQ-DSC，Malvern)检测不同NaCl浓度下蛋白随温度变化的热量变化，对照组为每个盐浓度透析后的透析外液，检测温度范围为 15～80 ℃。利用non-two-state拟合模型，计算AlyE2在不同盐浓度的熔解温度Tm。

2 结果与讨论

2.1 AlyE2为PL7_5家族褐藻胶裂解酶

AlyE2全长345个氨基酸，其中N端的前20个氨基酸为信号肽，除去信号肽共325个氨基酸残基，预测的分子量大小(MW)为36.0 kDa，预测的等电点(pI)为6.45。通过BLASTP工具检索AlyE2全长，AlyE2与PL7家族蛋白(GeneBank: WP_102290480.1)相似度达到100%。与CAZy中PL7家族已表征的褐藻胶裂解酶比较，同AlyE的序列相似度最高(95.07%)。得到PL7家族的全部蛋白序列，通过多序列比对确定AlyE2具有在PL7家族中保守的RXEXR、Q(I/V)H和YXKAGXYXQ(见图1)。依据多序列比对的结果建立进化树(见图2)，确定AlyE2属于PL7家族的第五亚家族(PL7_5)。

(所有序列来源于CAZy数据库PL7家族已表征蛋白，亚家族确定依据CAZy数据已有的分类。构建进化树采用邻接法且Bootstrap设置为1 000次。All sequences are derived from the characterized protein of the PL7 family in the CAZy database. The subfamily is determined based on the existing classification of the CAZy. The phylogenetic tree is constructed using the neighbor-joining method and bootstrap analysis of 1 000 replicates is conducted.)

2.2 通过重组表达与蛋白分离纯化获得重组AlyE2蛋白

对构造的重组载体测序，核酸电泳结果显示克隆产物分子量大小约为1 300 bp(见图3(a))，与预测大小相符，表明重组载体pET32a-alye2构建成功。如图3(b)所示，超声后上清中出现一条大小在44.3 kDa 附近的较粗的蛋白条带(红色箭头)，能与Ni-NTA结合，柱上酶切去除标签后最终获得一条36 kDa左右蛋白条带，纯化的重组蛋白的产率为10 mg/L。

((a)1：DNA Marker；2：alye2克隆片段;(b)1：蛋白Marker；2：表达菌体裂解液(箭头示Trx-His(6)-AlyE2融合蛋白)；3：纯化的AlyE2。(a) Lane_1: DNA Marker；Lane_2: alye2;(b) Lane_1: protein markers; Lane_2: crude extracts from E. coli (arrow for Trx-His(6)-AlyE2); Lane_3: purified AlyE2 without tags.)

2.3 重组蛋白AlyE2酶学性质

2.3.1 AlyE2是polyG特异性的褐藻胶裂解酶，主要产物是三糖 检测AlyE2对3种底物的酶解曲线，AlyE2对polyG有明显降解偏好性，对褐藻胶的降解速率比polyG低，对polyM几乎不降解，说明AlyE2是polyG特异性的褐藻胶裂解酶(见图4(a))。从降解过程分析，AlyE2对polyG和褐藻胶的降解，最终产物为DP为3～5的寡糖，其中三糖为主要产物(见图4(b)、(c))。

(AlyE2的底物偏好性(a)、褐藻胶降解产物分布(b)和polyG降解产物分布(c)。AOs：DP 2～4的褐藻胶寡糖； 1～5分别表示反应1、5、10、30、60 min的产物。Analysis of substrate specificity of AlyE2 (a), products distribution of alginate (b) and products distribution of polyG (c). Lane_ AOs: Unsaturated oligosaccharides(DP 2～4)； Lane_ 1～5: the degradation products at 1、5、10、30 and 60 min，respectively. )

2.3.2 金属离子和有机试剂对AlyE2活性影响 Mn2+和Ca2+对AlyE2活性有明显的促进作用，可以使活性增加40%； Cu2+、K+和Ni2+对AlyE2有抑制作用(见图5)。AlyE2在乙醇、异丙醇、正丁醇中能达到最高活性的20%～60%，在甲苯中能达到最高活性的70%，说明AlyE2可以在有机试剂中发挥作用，具备在有机环境应用的潜能。

图5 金属离子和有机试剂对AlyE2活性影响

2.3.3 AlyE2最适温度和最适pH 如图所示AlyE2的最适温度为30 ℃(见图6(a))，在20 ℃表现出最高活性的60%，当温度高于50 ℃时，蛋白丧失活性。AlyE2的最适pH为7.5，且在碱性环境(pH为7.0～9.0)中表现出较高的活性(见图6(b))。PL7家族的最适温度范围和最适pH范围分别为30～55 ℃和7.0～9.0[16]，AlyE2的最适温度和最适pH也在该范围内，该性质也与宿主海洋生活环境相适应。

图6 温度(a)和pH(b)对AlyE2活性的影响

2.3.4 AlyE2的动力学参数 AlyE2的动力学曲线如图7所示，通过计算得到最大反应速率Vmax为(39.62±0.11) μmol·L-1·min-1；米氏常数Km为(0.31±0.04) mg/mL。

图7 AlyE2降解褐藻胶的米氏曲线

2.3.5 AlyE2的活性和热稳定性均随NaCl浓度升高而增强 NaCl对AlyE2活性的影响较大，在0～1.0 mol/L范围内，随着NaCl浓度升高，活性逐渐变强，NaCl浓度力1.0～2.0 mol/L时，能明显促进AlyE2的活性，活性是对照组(NaCl浓度为0 mol/L)的2.5倍(见图8(a))。当NaCl浓度达到1.0～2.0 mol/L时，AlyE2活性保持在最高活性的95%以上，表现了AlyE2对高盐环境的适应性。同时通过本研究还发现AlyE2的热稳定性也与NaCl浓度有关，如图8(b)所示，与对照组浓度下相比，在NaCl浓度1.0～2.0 mol/L的条件下，AlyE2的Tm提高8～14 ℃，这说明NaCl可以提高AlyE2的热稳定性。综合NaCl对AlyE2活性及热稳定性的分析结果推测，NaCl浓度提高后AlyE2活性的升高可能与其稳定性的提高有关。

图8 不同NaCl浓度对AlyE2活性(a)和热稳定性(b)的影响。

AlyE2的活性受NaCl浓度的影响，该现象也在PL7家族已表征的褐藻胶裂解酶中有所报道。例如，AlyA最适NaCl浓度在1.0 mol/L，其活性约为对照组的10 倍[17]；AlyPM最适盐浓度在0.5～1.0 mol/L，其在NaCl浓度为1.0 mol/L时的活性是对照组的6倍左右[18]；AlyA-OU02最适盐浓度为0.2～1.0 mol/L，其在NaCl浓度为1.0 mol/L时的活性是对照组的2倍[19]；深海微生物来源的Nit-Aly最适盐浓度为0.8～1.4 mol/L，其在NaCl浓度为1.0 mol/L时的活性是对照组的20倍以上[20]；AlyM4最适NaCl浓度为1.0 mol/L，其活性是对照组的7 倍以上[21]；AlyC3最适NaCl浓度为0.5 mol/L，但当NaCl浓度达到3.0 mol/L时，酶活仍比对照组高25%[22]。虽然PL7家族褐藻胶裂解酶对NaCl表现的依赖性的现象非常常见，但对其机理的研究很少。AlyC3也是PL7家族对NaCl表现出依赖性的褐藻胶裂解酶，NaCl浓度可以对AlyC3的聚集状态产生影响，其中AlyC3二聚体具有活性，而其他聚集形式都未表现明显的活性，所以NaCl浓度的变化导致蛋白的聚集状态发生变化，从而使活性改变[22]。参照文献[22]的方法，发现NaCl浓度未对AlyE2的聚集状态产生影响。当NaCl浓度为0～2.0 mol/L时，温度稳定性的不断增强，酶活也逐渐升高，可以推测AlyE2的温度稳定性不断增强可能是其酶活不断升高的重要因素；当NaCl浓度大于2.0 mol/L时，虽然温度稳定性持续增强，但考虑在此浓度下蛋白因为强疏水作用和高离子强度等因素可能使酶活出现迅速下降的情况，最终使得AlyE2活性出现迅速下降。

3 结语

AlyE2是PL7家族具有polyG降解偏好性的内切型褐藻胶裂解酶，最适温度和pH分别为30 ℃和7.5，在1.0 mol/L NaCl浓度下活性最高，且当NaCl浓度升高到2.0 mol/L时，AlyE2仍能保持高活性，体现了AlyE2对高盐环境的适应性。本文还发现NaCl能增强AlyE2的热稳定性，可能是其活性升高的重要因素。AlyE2降解褐藻胶的产物为DP 3～5的寡糖分子，在生物活性寡糖制备方面有潜在应用价值。