N6-甲基腺苷甲基化在射血分数保留性心力衰竭中的作用的研究进展

张文珺 牛小伟 刘永铭

(1.兰州大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学第一医院心内科，甘肃 兰州 730000；3.兰州大学第一医院老年病科，甘肃 兰州 730000)

心力衰竭(心衰)是全球死亡的主要原因之一，其中射血分数保留性心衰(heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF)占50%以上，且发病率呈增高趋势。HFpEF的年死亡率为22%[1]。研究表明，HFpEF不是单纯由舒张功能障碍引起，心肌能量代谢障碍、肺动脉高压和内皮功能障碍等多种损害均可促进HFpEF的进展[1]。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修饰作为RNA最丰富的修饰之一，参与了肺动脉高压、高血压和冠心病多种心血管疾病的进展[2]。近年来，对于m6A与HFpEF的关系亦受到越来越多的关注。现拟综述m6A甲基化对HFpEF发生和发展的影响，以期为HFpEF的治疗提供新的研究思路。

1 m6A概述

m6A位于保守序列5’-RRACU-3’中，其甲基化主要发生在终止密码子附近的3’-UTR节段[3]，且其修饰动态可逆。m6A修饰受甲基化酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白的共同调控。甲基化酶包括：甲基转移酶样蛋白(methyltransferase like protein，METTL)3、METTL14和Wilms肿瘤1相关蛋白 (Wilms tumor 1-associated protein，WTAP)。去甲基化酶包括：脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein，FTO)和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶alkB同系物5(α-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 5，ALKBH5)。甲基化阅读蛋白识别修饰后的碱基，调控RNA加工、运输、翻译及稳定性等，包括：YTH结构域家族(YTH domain-containing family，YTHDF)1-3和YTH结构域蛋白1-2。此外，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1/2/3和真核起始因子3等也影响m6A甲基化。

2 m6A与HFpEF

m6A调节多种细胞过程，小鼠和人类中m6A转录本主要编码与新陈代谢过程以及心脏和循环系统发育有关的蛋白质[4]。研究发现，HFpEF患者METTL3、METTL14、FTO和YTHDF2的表达显著上调，WTAP表达呈下降趋势，ALKBH5呈上升或不变趋势[5-6]，表明m6A参与HFpEF的发生和发展，靶向调控m6A可能会成为HFpEF治疗的新策略。

2.1 m6A调节心肌肥厚与纤维化

HFpEF患者的心肌表现为向心性心室重塑和舒张功能障碍[7]。Dorn等[8]分离出新生大鼠的心肌细胞，用血清作为促肥大刺激因素，在含2%血清条件下培养48 h，通过测序确定m6A RNA修饰的百分比显著增加，且m6A在编码蛋白激酶和修饰物的mRNA中最显著富集。通过腺病毒载体提高METTL3水平后发现，丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、MAP3K5和MAP3K6水平升高，心肌细胞肥大，但敲除METTL3后肥大被阻断。METTL3过表达诱导心脏的代偿性肥厚重构，但不会导致基础或心脏应激状态下的心功能缺陷。敲除METTL3大鼠生长到8月龄时，心脏已出现类似于心衰的结构与功能异常，分离的成年心肌细胞在METTL3敲除后出现偏心重塑，进一步证明mRNA的METTL3和m6A修饰在维持心脏内稳态、功能和应激反应中的关键作用。METTL3也可通过调节PARP10-NFATC4信号轴调节心肌肥厚。沉默PARP10可阻断血管紧张素Ⅱ诱导的肥大反应，降低心房钠尿肽mRNA水平。心脏肥大相关的与Piwi蛋白相作用的RNA与METTL3相互作用，抑制Parp10 mRNA的m6A修饰，导致依赖于METTL3-YTHDF2的Parp10 mRNA的降解被阻断，PARP10的表达增加，进而抑制糖原合成酶激酶3β活性，增加NFATC4向核内转运并提高其活性，导致心肌肥大[9]。RE1-沉默转录因子为心肌细胞重构的关键调节因子，过表达METTL3影响RE1-沉默转录因子的翻译[5]。总之，METTL3和m6A水平诱导心肌细胞变化，影响心脏重构。

FTO是首个被确定的RNA去甲基化酶。近来研究发现，FTO可影响心衰患者心肌肥厚肌球蛋白重链相关RNA转运体(myosin heavy-chain-associated RNA transcripts，Mhrt)。研究发现，心衰小鼠心肌中FTO和Mhrt表达下调，过表达FTO增强Mhrt的表达，沉默FTO则使Mhrt表达下降，提示FTO通过调节Mhrt的m6A修饰来影响心肌肥厚[10]。利用大鼠心肌细胞实验研究证明，FTO的表达是瘦素依赖的肥大反应所必需的[11]。

研究发现YTHDF2也参与Parp10转录本的识别和降解，YTHDF2过表达降低心肌细胞中Parp10 mRNA的水平，进而参与调节心肌肥厚[9]。但目前对阅读蛋白的研究尚未见关于HFpEF中心肌肥厚的报道。

HFpEF中心肌细胞僵硬，肌成纤维细胞胶原沉积增加，导致舒张性左室功能障碍[7]。METTL3对纤维化相关转录本有重要影响。研究表明，过表达METTL3促进心肌纤维化和肌成纤维细胞的生成，同时促进细胞外基质的产生。在心肌纤维化小鼠模型中，敲除METTL3可有效地抑制心肌纤维化进展[12]。过表达FTO促进血管生成，改善心肌收缩功能，缓解心衰进程[10，13]。一项关于HFpEF和射血分数降低性心衰(heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF)的心内膜活检样本对比分析显示，HFrEF中胶原蛋白替代死亡的心肌细胞产生斑片状的纤维化区域，而HFpEF中则没有[7]，这可能与HFpEF过表达FTO有关。FTO也可调节与纤维化和肥大有关的长链非编码RNA[14]。因此，METTL3和FTO靶向调控m6A可能是一种治疗策略，用于管理HFpEF进展中心肌肥厚与纤维化。

2.2 m6A调节细胞自噬

自噬在HFpEF中起重要作用[15]，m6A通过多种途径影响自噬。Song等[16]证实，METTL3上调损害自噬通量并促进心肌细胞凋亡，ALKBH5过表达可逆转METTL3上调引起的心肌细胞损伤。METTL3可通过AMP活化的蛋白激酶哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径，使转录因子EB m6A残基甲基化，降低转录因子EB的表达[3，16]。过表达METTL3也可降低Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子3(RhoGEF3)的表达水平，RhoGEF3是自噬调节因子雷帕霉素靶蛋白C1激活剂[11]。实验证明，FTO过表达可降低心肌细胞半胱氨酸蛋白酶3和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)的表达，增强B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)表达，沉默FTO则抑制Bcl-2表达[10]。

HFpEF患者活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加。ROS调节许多信号转导通路，在自噬中发挥关键作用。髓系分化蛋白1激活ROS介导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，放大HFpEF中心肌细胞的自噬效应。在HFpEF模型中，特异性自噬指标微管相关蛋白轻链3表达增加[15]。Jin等[17]发现，敲除FTO，自噬标记轻链3B下降，自噬底物水平升高，过表达FTO则相反，表明FTO正向调节自噬过程。此外，FTO也可上调蛋白激酶ULK1蛋白水平促进自噬。以上研究表明，m6A水平升高可能通过抑制自噬发生而发挥改善心功能的作用。

2.3 m6A调节炎症与氧化应激

现有观点认为全身性促炎状态是HFpEF心肌结构和功能改变的原因[7]。METTL3在调节炎症方面起着重要作用。METTL3通过改变相关通路磷酸化水平和调节髓系分化因子mRNA剪接来调节多种炎性细胞因子和与炎症反应相关的基因表达水平[3]。METTL3通过抑制巨噬细胞内MAPK和核因子κB(NF-κB)信号通路，抑制脂多糖刺激下的炎症反应[12]。

巨噬细胞分为两种极化类型，M1型(经典激活的巨噬细胞) 启动和维持炎症，M2型(交替激活的巨噬细胞)具有抗炎作用，m6A同时影响二者的极化。研究证明，过表达METTL3信号转导及转录激活因子1(STAT1)促进M1型极化，削弱M2型极化。FTO通过YTHDF2介导的NF-κB信号通路调节巨噬细胞极化。敲除FTO基因降低STAT1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ的mRNA的表达，抑制巨噬细胞极化[18]。YTHDF2也可与RNA结合基序蛋白4相互作用，影响STAT1 mRNA的表达，影响M1极化[19]。Yu等[20]证明，YTHDF2通过NF-κB和MAPK通路调节MAP2K4和MAP4K4的mRNA稳定性，并负性调节内毒素诱导的炎症反应。

调节性T细胞有免疫抑制作用[21]。敲除METTL3后，抑制性调节因子mRNA水平升高，抑制IL-2/STAT5信号通路，调节性T细胞数目和功能降低，免疫抑制功能降低[22]。

HFpEF患者全身的炎症状态促进ROS的产生，诱发氧化应激[15]。ROS可通过促进心肌细胞僵硬、诱发心肌重构和纤维化等方式促进HFpEF的发生[23]。METTL3升高m6A水平，以抗氧化应激方式减轻多黏菌素所致的肾损伤[24]。Chen等[25]也证明m6A减少可增加氧化应激过程。同时ROS还与细胞自噬有关[15]。因此，m6A在炎症与氧化应激过程中起负性调控作用，从而发挥心肌保护作用。

2.4 m6A调节糖脂代谢

糖尿病是HFpEF的危险因素，m6A可影响血糖水平。研究表明，m6A在胰岛β细胞中显著减少，提示m6A控制细胞胰岛素分泌。低m6A下调胰岛素/IGF1-Akt-PDX1通路，损害胰岛素分泌[12]。Xie等[26]发现，敲除METTL3可降低脂肪酸合成酶mRNA水平，改善胰岛素敏感性。糖异生关键酶、葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1在FTO敲除后下调，证明FTO是影响小鼠糖异生的关键因素[3]。m6A通过参与胰岛素分泌、胰岛素抵抗和肝脏糖异生的调节，间接影响HFpEF。

脂肪组织对于维持代谢稳态至关重要，m6A参与脂肪形成。研究发现，m6A相关单核苷酸多态性与血脂代谢相关[27]。实验表明，由WTAP、METTL14和METTL3组成的RNA m6A-甲基转移酶复合物通过促进3T3-L1细胞成脂过程中有丝分裂克隆增殖的细胞周期转变，对成脂起积极调节作用[12]。锌指蛋白217增加METTL3表达，从而上调3T3-L1细胞中m6A的水平，加速脂肪生成[12]。研究显示，敲低METTL3可降低过氧化物酶体增殖物激活受体α水平，减少脂质蓄积[28]。FTO通过影响成脂调节因子RNA的剪接，影响前脂肪细胞的分化。研究表明，敲除FTO降低细胞周期蛋白依赖性激酶2和关键细胞周期调节因子的蛋白表达，以m6A-YTHDF2依赖的方式抑制脂肪形成[12]。m6A通过YTHDF1促进patatin样磷脂酶结构域蛋白2的翻译，从而抑制脂肪生成[12]。Song等[16]最近的一项研究表明，锌指蛋白217也可激活FTO表达，以m6A-YTHDF2依赖方式促进脂肪生成。总之，多个糖脂代谢过程中的关键基因m6A水平会受到调控，最终影响HFpEF患者的血糖和血脂。

3 小结

HFpEF和HFrEF是一类疾病的两种状态，二者存在共同的发病机制，但针对HFrEF的治疗方案不能改善HFpEF的存活率，提示二者潜在机制存在不同。研究发现，HFrEF生物学过程主要与序列特异性DNA结合、丝氨酸肽酶磷酸化和平滑肌细胞增殖有关，且与细胞增殖和代谢增加有关的蛋白激酶B信号和MAPK级联相关的生物通路也丰富，而HFpEF特有的生物通路与炎症、中性粒细胞脱颗粒和整合素信号通路有关[29]。因此，HFrEF以心肌肥厚和代谢障碍为主，HFpEF以炎症和细胞外基质增生为主。

本文从心肌肥厚与纤维化、自噬、炎症与氧化应激以及糖脂代谢四个方面系统综述m6A在HFpEF中的作用，表明m6A参与了HFpEF的病理生理过程。目前仍有部分机制尚未阐明，如HFrEF和HFpEF既有联系又有区别，这其中m6A又是怎样发挥作用的？甲氯芬那酸是FTO的选择性抑制剂，可增加人类细胞中m6A水平[16]，它能否用于HFpEF的治疗？这些都需进一步研究论证。相信随着研究的深入，将进一步阐明m6A在HFpEF中的确切作用以及可能的预测价值，为HFpEF的治疗提供潜在的新靶点。