分子影像探针在血栓性疾病早期诊断中的研究进展

李博 杨童 刘锦 蒋鹏 周倩

(1.广东药科大学中医药研究院，广东 广州 510006；2.暨南大学生命科学学院，广东 广州 510632；3.中国医学科学院输血研究所，四川 成都610052)

血栓是指由血管壁损伤或炎症引起诸如胶原、组织因子及凝血酶等激活，进而诱发局部血小板及纤维蛋白活化，并形成斑块的病理过程[1]。临床数据表明，由动脉粥样硬化斑块剥离等偶发事件导致的急性血栓会在血管内随机附着并快速增长，其是心肌梗死、肺栓塞及卒中等严重临床事件的主要诱因，每年血栓性疾病致死人数占全球死亡人数的25%[2]。因此，血栓的早期诊断具有重大临床意义。然而，现阶段临床影像学仅能识别晚期血栓，对血栓形成缺乏灵敏性及特异性，开发针对血栓形成的分子影像探针刻不容缓[3]。

随着微纳米技术的蓬勃发展，靶向标志物的分子探针方兴未艾，前景广阔。血栓形成包含血管上皮细胞和血小板无序活化、凝血酶激活、纤维蛋白生成及红细胞附着等生理过程，这些关键组分被认为是血栓形成的标志物分子[4]。现综述微纳米探针在血栓诊断领域的研究进展，并对其临床转化前景进行展望。

1 基于血小板的分子成像

血小板是血栓形成的关键组分，其一般处于静息状态，当血管内壁受损或炎症发生时，血小板被激活进入活化状态，形成血栓[5]。研究表明，血小板从静息状态进入活化状态后，其表面会高表达P选择素；同时，糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(glycoprotein Ⅱb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa)亦会转变为对纤维蛋白具有高亲和力的构象[6]。因此，这两种分子可作为区分静息和活化血小板的标志物，用来鉴定早期血栓。

1.1 P选择素

血小板激活表达P选择素后，可通过其糖蛋白配体-1将白细胞募集至病灶区域参与血栓形成。因此，将P选择素抗体或糖蛋白配体-1重组靶向配体与造影剂相偶联，将有望通过靶向活化血小板实现血栓特异性成像。Lindner等[7]率先将P选择素单抗与脂质体微泡(microbubbles，MBs)偶联，证实其能提高炎症病灶的超声信号。Davidson等[8]将MBs与糖蛋白配体-1重组靶向配体偶联，发现其在心肌缺血再灌注模型中能实现病灶区域的超声分子成像。Appeldoorn等[9]发现没食子酸修饰的Glu-Trp-Val-Asp-Val短肽(GA-EWVDV)与P选择素具有特异性高亲和力(IC50=15.4 nm)，其可作为P选择素靶标分子。Xu等[10]将四氧化三铁(Fe3O4)、全氟己烷(perfluorohexane，PFH)和墨汁装载入聚乳酸乙醇酸(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)纳米结构，并在其表面用GA-EWVDV修饰得到纳米体系，其能靶向血栓性病灶并提供光声、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)和超声三模成像。尽管上述分子探针已取得一定成果，但肽类及蛋白质类配体制备耗时长、花费高，且在体内循环系统中极易被降解，其临床应用需进一步验证。

褐藻糖胶是海藻中提取的一种天然多糖，其被证实与P选择素具有高亲和力。99mTc标记的褐藻糖胶(99mTc-Fuco)能通过靶向P选择素，实现血栓的单光子发射计算机断层成像(single photon emission computed tomography，SPECT)[11]。Suzuki等[12]将褐藻糖胶修饰到超小顺磁纳米颗粒上，证实其能靶向活化血小板并实现血栓的MRI分子成像。Li等[13]通过聚合反应得到褐藻糖胶修饰的微泡(Fuco-MBs)，其能在体内靶向富集到新生静脉血栓并提供超声信号；当施加瞬时高频超声后，MBs结构会被破坏，从而丢失超声信号，Fuco-MBs被证实其有望实现体内血栓的定量分析及溶栓药物的超声控释。Nguyen等[14]借助多元醇构建了褐藻糖胶包被的掺杂铁元素的超小型氧化锌纳米体系，其具有磁性及荧光特质，靶向富集血栓后能提供病灶区域的MRI及荧光双模成像。2019年完成了有关99mTc-Fuco的临床Ⅰ期评估，证实其良好的体内分布效应及生物安全性，Ⅱ期临床试验即将开展对患者不稳定新发血栓的临床检测研究，这些成果将为基于褐藻糖胶的分子探针临床转化应用奠定基础[15]。

1.2 GPⅡb/Ⅲa

GPⅡb/Ⅲa隶属于整合素蛋白家族，其在血小板上高表达。当血小板被激活后，GPⅡb/Ⅲa构象从与纤维蛋白原的低亲和力构象转变为高亲和力构象，诱发血小板聚集而形成血栓。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycinema-aspatic acid，RGD)短肽被证实能模拟纤维蛋白原与GPⅡb/Ⅲa结合，其偶联造影剂可用于血栓成像[16]。Hu等[17]利用环状RGD(cyclic RGD，cRGD)与MBs偶联得到Mb-cRGD，证实其能增强腹腔动脉血栓超声信号，在多普勒成像辅助下可进一步确认血管狭窄程度。Ye等[18]将钆(Gd)和超顺磁氧化铁封装到cRGD功能化的脂质体得到cRGD@MLP-Gd，其能靶向活化血小板并增强病灶区域MRI的T1和T2造影信号，提升血栓诊断的精确性和灵敏性。Rix等[19]将cRGD修饰到聚氰基丙烯酸正丁酯构建的MBs上，得到可长期稳定保存的超声造影剂cRGD-MB，证实其能监视血管受损后的炎症发生及血栓形成。Kang等[20]将二聚cRGD通过链亲和素/生物素与荧光分子Alexa Fluor 680偶联，并进一步用64Cu标记，得到可检测GPⅡb/Ⅲa表达水平的正电子发射断层扫描(positron emission tomography，PET)/光学双模成像分子探针。Wu等[21]近期将RGD修饰到近红外二区荧光分子TTQ的表面得到TTQ-PEG-cRGD，其不但能在小鼠颈动脉血栓区域提供近红外二区荧光信号，还能区分新旧血栓，该体系为早期血栓非侵入精准影像学鉴定提供了新的思路和方法。Bai等[22]通过多步乳化法将PFH和吲哚箐绿(indocyanine green，ICG)共封装入PLGA纳米结构，并在其表面修饰cRGD后得到PLGA-cRGD-PFH-ICG纳米平台，证实其能靶向富集到冠状动脉微血栓病灶并通过ICG实现光声和荧光双模成像。同时，PFH在超声触发下还能形成空化效应，发挥溶栓效果。基于RGD靶向GPⅡb/Ⅲa的分子探针开发取得了一定进展，但由于RGD无法区分未激活和激活状态的GPⅡb/Ⅲa构象，该类分子探针理论上可与所有血小板结合，其成像效果仅依赖于血栓区域血小板与循环系统血小板的信噪差，特异性有待进一步提高。

近期，可特异性靶向GPⅡb/Ⅲa激活构象的单链抗体(single-chain variable antibody fragment，svFv)受到广泛关注。基于svFv的分子探针也已在血小板活化相关的多种疾病中取得初步成果。Lim等[23]将近红外荧光分子与svFV偶联后，证实其可用于血栓早期三维光学成像。单链抗体与MBs和氧化铁纳米颗粒偶联后，也展示出与早期血栓较强的特异性结合能力[24]。Ta等[25]将单链抗体与具备MRI T1和T2双重造影特性的超小型磁性氧化铁纳米粒子偶联，实现了小鼠颈动脉血栓的MRI双模造影成像，其克服了T1或T2单独成像的缺陷，显著提高了血栓检测的精准性。Li等[26]将svFv通过“点击反应”修饰到具有荧光及磁性双重特质的DBM-NaGdF4表面，证实其能靶向聚集到高表达GPⅡb/Ⅲa区域，提供MRI和荧光双模造影信号。

2 基于纤维蛋白的分子成像

纤维蛋白是血栓形成中的另一个关键因素，其在血栓形成初期往往浓度较高，后期逐渐被胶原蛋白或其他纤维蛋白所取代[27]。基于此，设计开发靶向纤维蛋白的分子探针将有望为血栓早期影像学鉴定提供帮助。

Botnar等[28]率先合成了能与纤维蛋白特异性结合的含Gd短肽(EP-1873)，其可实现易损斑块的MRI分子成像。Overoye-Chan等[29]用羟基脯氨酸、氯酪氨酸及谷氨酸取代修饰EP-1873得到新型短肽EP-2104R，其具备更好的靶向和造影效果，动物模型证实其能实现冠状动脉血栓和肺栓塞的MRI分子成像。Ay等[30]将EP-2104R用64Cu标记后，其能实现大鼠血栓PET成像；而当溶栓治疗后，其病灶区域信号减弱甚至消失，表明该探针可用于血栓成像及定量分析。考虑到Gd对肾功能不全患者的安全风险，Gale等[31]以EP-2104R为模板，用锰基螯合物取代Gd制备了Mn-FBP探针，其在颈动脉血栓模型中显示出与EP-2104R相当的造影效果，为开发适用于肾功能不全人群的非Gd血栓分子探针奠定了基础。在另一项研究中，Oliveira等[32]将EP-2104R用68Ga或111In标记，证实其能实现血栓的SPECT/PET/CT三模成像。Hara等[33]则以EP-2104R为基础设计了近红外染料标记的肽，证实其能实现颈静脉血栓荧光成像。尽管EP-2104R现阶段已开展部分临床试验，但尚无产品获批临床使用。

3 基于凝血酶响应的分子探针

凝血酶主要通过将纤维蛋白原裂解为纤维蛋白，使后者发生交联反应而稳定血栓结构，其在血栓形成阶段往往表达活性升高，亦可作为早期血栓性疾病的生物标志分子。

近期，Lux等[34]将凝血酶敏感的细胞穿膜肽(ACPP)与MBs偶联，其能在血栓区域通过凝血酶特异性裂解ACPP而暴露MBs正电荷表面，黏附至带负电荷的红细胞表面从而实现血栓分子的造影成像。Kwon等[35]将近红外荧光分子Cy5.5通过凝血酶响应肽偶联至二氧化硅包裹的金纳米颗粒表面，得到荧光/CT双模分子探针TAP-SiO2@AuNPs，其在正常生理状态下，Cy5.5信号被AuNPs淬灭而无成像效果；在血栓区域，结构中的连接肽可被凝血酶特异性切割，从而释放Cy5.5发出荧光信号，AuNPs则可通过纳米尺寸效应积聚至血栓部位，从而实现病灶区域的荧光/CT双模造影成像。类似地，Wang等[36]利用凝血酶敏感肽(LASG)将荧光分子FITC与Fe3O4偶联得到FITC-LASG-Fe3O4分子探针，正常情况下其FITC信号会被Fe3O4所淬灭，而当LASG被血栓区域凝血酶特异性切割时，其释放的FITC才会呈现信号，从而联合Fe3O4实现病灶区域荧光/MRI联合可视化成像。

4 基于双靶向系统的分子探针

不同于肿瘤等疾病的分子探针，血栓分子探针需面临高血流剪切力冲击考验，其与血栓标志物的黏附强度及滞留时间将直接影响其提供的造影信号。构建针对不同靶标的双配体探针将有望提高靶向富集效率并延长滞留时间，从而达到增强血栓分子成像信号的目的。Zhang等[37]将cRGD与GA-EWVDV共同修饰到聚多巴胺纳米表面，相比单肽修饰的纳米体系，双肽修饰的纳米结构对不同类型的急性血栓均展示出更高的靶向富集效率及更长的滞留时间，显著增强了血栓的MRI和光声双模成像效果。Günther等[38]将能与GPⅡb/Ⅲa特异性结合的抗体及P选择素天然配体sialyl lewis X共同修饰到MBs表面，构建了双重靶向超声造影剂(MBDual)；在体外模拟中，其与血小板的黏附能力明显高于单配体修饰MBs，且MBDual在体内颈动脉血栓模型也显示出较高的超声信号。近期，Yang等[39]将纤维蛋白靶向肽与ACPP共修饰至脂质体纳米表面，证实了纤维蛋白靶向肽与ACPP的双靶向组合能显著提高纳米体系的靶向效率和渗透效率，从而更有利于实现血栓的3维立体精准成像。相比于单配体探针，双配体修饰的分子探针在血栓病灶黏附强度、滞留时间及渗透效率方面展现出更大优势，其为血栓的精准成像提供了全新的思路。

5 小结与展望

尽管基于血小板、纤维蛋白及凝血酶等血栓关键组分的分子影像探针已取得一定成果，但其仍有各自不足[40]。例如，静脉血栓中血小板占比远低于动脉血栓，导致基于血小板的分子探针在静脉血栓成像中效果不佳；而纤维蛋白不仅在血栓部位表达，还在血管炎症部位表达，其分子探针存在脱靶风险；此外，凝血酶往往存在于血栓内部，物理阻隔也成为响应型探针成像效果的限制因素；同时，肽类分子探针往往面临体内降解风险，其稳定性也需更多研究。在未来，更多血栓标志物的发现和加入将为开发多元化血栓分子探针带来机遇，这些成果在血栓早期诊断方面具有广阔的应用前景，其终将为临床患者带来帮助。