多级冷凝耦合GC-MS分析金银花中挥发性物质*

马 飞，赖玥华，黄 颂，刘旎璇，段春娜

(赣南师范大学 地理与环境工程学院，江西省城市固废低碳循环技术重点实验室，江西 赣州 341000)

在中国的传统医学中，金银花(Lonicera japonica)作为治疗普通感冒和发烧使用已有数千年的历史[1].同时，因其独特的药用功效和芳香气味，而被广泛的应用作为茶饮料的原料[2].化学成分研究表明，金银花富含有机酸、黄酮类化合物、皂苷、挥发油和芳香性物质[3-6].特别是，挥发油(挥发性组分)作为金银花气味和发挥药理作用的主要组成部分，将其应用于茶，食品和香烟等制品，有助于提升香味和口感[7].因此，从金银花中提取挥发性成分，并揭示挥发性成分与气味之间的关系具有重要的意义和价值.

从植株中提取挥发性成分的传统方法包括，加速溶剂萃取(ASE)、蒸馏提取(SD)和同时蒸馏提取(SDE)[8-11].然而，这些方法在使用时均存在一定的局限性，如过程耗时，操作繁琐，需使用大量的溶剂等[12].因此，更多先进的萃取技术被开发，以达到小溶剂提取，高产量回收的目的[13].例如，超临界流体萃取(SFE)、加压液体萃取(PLE)、超声波辅助萃取(UAE)等[14-18].但是，由于以上设备投资成本高、技术操作专业性强，因此在大范围推广应用方面受到一定的局限.多级冷凝作为一种操作简单，成本相对较低的粗分离技术，应用得当可有效降低后续分离和纯化的技术成本[19].在多级冷凝过程中，依据样品蒸气中各组分不同的物理和化学特性，热解的样品蒸气将通过系列温度点的冷凝器被逐级冷凝，达到样品分离的目的[20].目前，多级冷凝技术已被广泛应用于生物质资源富集[21-23].同时，有研究人员发现利用多级冷凝可以更有效地将生物油中的某些成分分离出来，并提高生物油的品质[24-27].多级冷凝技术因具有溶剂消耗少，操作简单和回收方便等优点，近年来被改进用于分析烟草中的复杂挥发性成分，并从中成功的收集到30种重要的与烟草气味和口感相关的挥发性成分[28].

基于以上，本文通过构建多级冷凝装置，优化蒸发温度、载气流量和冷凝区间等参数，收集到一系列金银花挥发性组分，进一步结合GC-MS分析各组分在多级冷凝装置中的分布特点并描述其气味特征.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

QP2010Plus GC-MS(含自动采样机型号AOC-20I，日本岛津公司)；XL-45自增压液氮罐(泰来华顿，美国)；GBRT-高温套式恒温器(上海学森仪器有限公司)；

金银花(广州同仁堂药房)；500 mL乙醇(分析纯)；500 mg乙酸苯乙酯(标准品，百灵威科技有限公司)；1 mg/mL C4-C30烷烃混标(百灵威科技有限公司)；1 000 mL叔丁基甲基醚(99%纯度，百灵威科技有限公司).

1.2 实验装置

构建的多级冷凝装置同文献[28]，详见图1.该装置由5个部分组成：冷源、蒸发器、冷源传输线、冷凝器和采样管.采样管采用玻璃材质(L型设计结构，长度20 cm)，冷凝器由两对传输板组成(单板尺寸，长×宽×高：1 m×20 cm×1 cm).冷源传输线(S形弯曲铜管：内径5.0 mm，长度5.0 m)，位于传输板底部，作为冷源传输通道.通过改变冷源传输线的排列间距，设计3种不同模型，作为后续温度范围优化.(型号1：18.0 cm,16.0 cm,13.0 cm,12.0 cm,9.5 cm,11.0 cm,11.5 cm,10.0 cm,11.0 cm,10.0 cm,10.0 cm,9.5 cm,8.5 cm,8.0 cm,7.0 cm;型号2:18.0 cm,16.0 cm,12.0 cm,12.0 cm,8.0 cm,10.5 cm,12.5 cm,10.5 cm,12.5 cm,8.5 cm,10.0 cm,9.5 cm,11.5 cm,7.5 cm,7.0 cm;型号3:23.5 cm,16.0 cm,15.0 cm,11.5 cm,11.5 cm,9.5 cm,12.0 cm,11.5 cm,14.0 cm,12.5 cm,12.0 cm,10.5 cm,10.0 cm,8.5 cm,7.0 cm,7.0 cm.)

图1 金银花挥发油多级冷凝示意图

1.3 标准溶液配制

准确称量0.135 g苯乙酸乙酯于100 mL容量瓶中，并用叔丁基甲基醚(TBME)稀释至刻度线，配制成浓度为1.35 mg/mL的内标溶液.

1.4 样品捕集流程

取30.0 g金银花放入蒸发器，恒温(150 ℃)加热蒸发样品.采用液氮为冷源，使用自增压装置调整冷凝温度区间并保持相对稳定.以N2为载气，以恒定流量1 000 mL/min将蒸发的金银花挥发组分送入多级冷凝器并持续冷凝30 min，向每根捕集管中加入2.0 mL的乙醇，摇动并充分的溶解后转移1.0 mL至事先准备好的色谱瓶，以备GC-MS分析.

1.5 气质条件

通过气相色谱-质谱仪(GC-MS)对挥发性组件进行定性分析，RTX-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm；薄膜厚度0.25 μm).程序升温条件：以2 ℃/min从60 ℃增加到180 ℃，并以5 ℃/min进一步提高到230 ℃(保持15 min).其他设置条件如下：进样口温度为260 ℃，载气(He)恒定流量为2.0 mL/min，接口温度为240 ℃；电离：EI70 eV，分流比1∶10，溶剂延迟时间为2.5 min.

2 结果和讨论

2.1 多级冷凝温度优化

为便于考察冷凝温度对样品组分多级冷凝影响，稳定而宽泛的温度梯度是前提条件.在冷凝器固定的情况下，冷源的初始温度和冷源传输间隔对冷凝器整体温度影响较大.以液氮(-196 ℃)为冷源，通过自增压控制冷源传输量维持温度稳定性，研究不同冷源转移间距对温度梯度的影响，如表1所示.利用温度传感器分别测量模式1、模式2和模式3条件下，形成的温差区间为：57 ℃、67 ℃和65 ℃.显然，模式2条件下，形成的温差区间更加宽泛.

表1 冷源转移间距对温度的影响

在以上模式2的条件下，保持冷源传输量和冷源传输间距不变，平行3次实验，考察冷凝器温度区间的稳定性，如表2所示.通过3次平行实验，冷凝温度平均偏差为0.43，相对标准偏差为0.85%，说明构建的冷凝器温度区间相对稳定，具有较好的重复性.

表2 冷凝温度区间稳定性

2.2 样品捕集过程

根据相同温度下，沸点和饱和蒸汽压之间的差异，当挥发性物质被引入冷凝器时，各组分在不同温度点的捕获管中被逐级凝结，以达到分离的目的.

2.2.1 样品蒸发温度的影响

样品挥发速率和挥发组分受样品蒸发温度的影响，温度越高，样品蒸发越快，单位时间内挥发性组分越多.但随着蒸发温度增加，部分挥发性物质易发生热解，同时维持冷凝所需的冷量消耗也增加.在相同的载气流量(1 000 mL/min)、相对稳定的冷凝温度区间(-61 ℃～6 ℃)条件下，分别考察蒸发温度为100 ℃、150 ℃和200 ℃时冷凝多级捕集效果.结果表明，在蒸发温度从100 ℃增加至150 ℃时，被冷凝器捕集的挥发性组分数量明显增加，150 ℃时共收集到66种挥发性组分.但继续增加温度至200 ℃时，挥发性组分仅增加5种，且代表金银花的风味和香气成分的含量并未增加.说明采用150 ℃作为蒸发温度，不仅能够获得金银花特征挥发性组分，而且所需的能耗更低，可作为最佳条件使用.

图2 不同蒸发温度下金银花样品总离子流图

2.2.2 载波气体流量的影响

为探索载气流量对样品挥发性组分多级冷凝的影响，在相同实验条件下，分别考察600 mL/min和1 000 mL/min的载气流量下，挥发性组分在冷凝捕集1#、5#、10#和15#管中被冷凝情况，如图3所示.当载气流量较小时(600 mL/min)，挥发性组分主要集中在前5根冷凝捕集管中，冷凝组分相对集中，多级效果不明显；载气流量较大时(1 000 mL/min)，挥发性组分被多级冷凝到15根冷凝捕集管中，冷凝组分相对分散，更有利于后续各组分的分离和纯化.以上结果表明，在冷凝温度一定的情况下，较快的载气流速更有利于挥发性组分的传输和扩散，有助于各组分在多级冷凝器的多级分离.

图3 在600 mL/min和1 000 mL/min的载气流量下，捕集管中样品组分的总离子色谱

2.3 挥发性组分物性及分布特征

选择在蒸发温度150 ℃，载气流量1 000 mL/min，冷凝温度区间6 ℃～ -61 ℃条件下，收集各捕集管中挥发性组分，将收集的样品取1 μL进GC-MS分析，结果共分析出66种化合物，主要成分32种，包括：4种有机酸、7种酚类、8种酮类、3种醇类、2种醛类、2种酯类和6种杂环类化合物.

挥发性物质的分布特征与沸点和饱和压力有很大关系，沸点较高的挥发性物质将首先被凝结.丙酸(沸点：414.25 K，饱和压力：1.33 kPa(39.7 ℃)，相对百分比含量：3.55%)主要被集中冷凝在1#～4#捕获管.丁酸(沸点：436.65 K，饱和压力：0.10 kPa(25 ℃)，相对百分比含量：0.75%)主要被冷凝在1#～2#捕获管.仅在1#捕获管中检测到戊酸(沸点：459.65 K，相对百分比含量：1.10%).结果表明，沸点较高的挥发性成分在捕获管中的分布较窄，同时7种酚类酸性有机物，主要分布在1-8#捕集管.例如：丁香酚具有丁香味、邻苯二酚具有辛辣气味，被广泛应用于食品、医药等领域.此外，酮类和醛类化合物作为重要的挥发性物质也被多级冷凝在不同捕集管.

表3 挥发性组分的气味和分布特征

2.4 挥发性成分粗回收

相较于单级冷阱或二级/三级串联冷阱，本文构建的多级冷凝装置可提供更加多样的温度点和更广泛的冷凝区间.苯甲醛和环己酮作为金银花挥发油中的代表性物质，其在香料、有机合成、食品和制药等领域具有较好的应用价值.

如表4和表5所示，苯甲醛和环己酮分别被该装置冷凝在1#～12#和1#～8#捕集管.将冷凝捕集管1#、7#、8#和10#内组分进行回收，获得的苯甲醛占总回收组分的57.14%；同理，将冷凝捕集管2#、5#和6#内组分进行回收，获得的环己酮占回收组分的68.14%.因此，通过以上实验表明：基于多级冷凝分离，选择不同捕集管可实现苯甲醛和环己酮与其他化合物的粗分离和粗回收.

表4 苯甲醛的粗分离

表5 环已酮的粗分离

3 结论

通过构建一套多级冷凝装置，获得稳定而宽泛的温度区间.在最佳条件下：冷凝温度范围在6 ℃～-61 ℃，样品烘烤温度150 ℃，载气流量1 000 mL/min.利用GC-MS从金银花挥发油中分析出32种主要组分，其中42.42%物质对金银花香味具有贡献.同时，采用多级冷凝技术实现57.14%的苯甲醛和68.14%的环己酮粗分与回收.该技术对温度较敏感的天然产物中挥发性与半挥发性物质的分离与回收具有潜在的应用价值，后续有望通过工艺和能耗优化，发展成为一种新型的分离回收技术.