富硅稻壳灰对水稻吸收砷的调控作用

李翔鸿，陈克云，黄荣荣，何勋文，王 昊，王 欣*，吴珂萌，戴宏博，彭 渤

1.湖南师范大学地理科学学院，湖南长沙 410081

2.湖南省农业对外经济合作中心，湖南长沙 410029

3.永州市农业综合服务中心，湖南永州 425599

4.道县农业综合服务中心，湖南永州 425399

砷(As)是一种植物非必需的类金属，被视为第Ⅰ类致癌物[1]，食用As含量超标的稻米易诱发各类疾病，对人体健康造成重大危害[2].2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，中国土壤As的污染率高达2.7%，湖南省是我国重金属污染最严重的省份之一[3-4].有研究[5]表明As已经成为威胁中国粮食安全的首要类金属污染物.谷物类中受土壤As影响最为明显的作物是水稻[6].Williams等[7]研究表明，水稻籽粒中As浓度为0.6 mg/kg时，水稻土的As污染浓度只有10μg/g.这是因为在淹水环境下，As主要以毒性较强的还原态亚砷酸盐〔As(Ⅲ)〕存在于土壤溶液中，转运通道Lsi1和Lsi2作为Si的吸收通道与此同时也高效地吸收As[8-9]，经木质部和韧皮部转运大量积累于籽粒中而造成稻米As污染.因此，为提高我国稻田土壤质量和实现稻米安全生产的现实需求，寻求高效的水稻土As污染修复技术已刻不容缓.

硅(Si)以单硅酸的形式存在于土壤溶液中并被植物吸收，然后以非晶态二氧化硅的形式沉淀在植物中.作为典型的硅积累物种，水稻(Oryza sativa)的高产和可持续的生产力尤其需要Si[10-11].Si通过缓解各种非生物胁迫(包括干旱、盐、倒伏和养分失衡等)和生物胁迫(如植物病原体和害虫等)对水稻生长和产量产生极其重要的积极影响.此外，研究表明，施用硅肥是缓解水稻籽粒和秸秆中As积累的有效策略[12-14].Si与As在共享运输途径下，外源Si的增加会竞争性地抑制水稻根系对As(Ⅲ)的吸收和长距离转运.Bogdan等[15]认为，孔隙水中Si浓度与水稻籽粒中总As浓度呈显著负相关，表明土壤可溶性Si在减缓籽粒As积累中起着关键性作用.Li等[16]发现，As污染土壤中施加硅肥使糙米中的总As和无机As(inorganic As，iAs)浓度与对照相比分别降低了24.1%和20.1%，表明足量Si的供应是减少水稻对As吸收的切实可行的方法.其次，外源Si的添加通过加强水稻通气组织的形成促进更多的气体交换，从而增强根系氧化和铁膜的形成.铁膜的形成通常被认为是水生植物适应厌氧条件的机制之一，同时，由于铁膜上铁氧化物的官能团通过吸附和/或共沉淀的方式截留重金属，所以促进铁膜的形成可抑制植物组织对重金属的吸收.Wu等[17]研究表明，施用Si显著提高了水稻铁膜中的铁浓度，同时使水稻根和秸秆中的As浓度与对照相比分别下降了28%~35%和15%~35%.然而，由于合成硅肥(如硅酸钙或硅胶)价格高昂，同时，风化良好的亚热带和热带水稻土壤和长时间的水稻种植会带走大量Si，导致土壤中的Si消耗殆尽，所以，寻找来源稳定且廉价易得的硅肥显得至关重要.

稻壳是一种水稻生产中利用不足的副产品，是水稻中Si积累最丰富的组织，由高达20%的SiO2组成.Si以硅酸的形式被根系吸收后，被蒸腾流携带并在稻壳中聚合形成无定形二氧化硅.Seyfferth等[18]发现，将稻壳灰掺入As污染土壤中，在淹水条件下会使籽粒As浓度降低20%；Teasley等[19]发现，与CaSiO3相比，稻壳能显著降低籽粒中As浓度且提高水稻产量.为了有效限制水稻根系对As(Ⅲ)的吸收和运输，迫切需要提高稻壳中Si的释放.

根据实用新型专利“一种稻壳灰低温碳化炉(202220547798.1)”，用特制的燃烧炉燃烧稻壳制备稻壳灰，利用该燃烧炉获得较低的燃烧温度(600℃左右)，在低温度条件下燃烧稻壳会形成结晶度较低的SiO2，Si的可溶性增加有利于水稻的有效吸收.该文将制得的富硅稻壳灰(Si-ash)应用到大田试验中，探讨并验证富硅稻壳灰在自然环境中调控水稻对As吸收的效果，以期为重金属As污染防控和As污染土壤的安全利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验区位于湖南省永州市道县清塘镇(25°30'25''N、111°26'42''E)，属典型的亚热带季风气候，双季稻种植区. 田间水稻土翻耕均匀后，采集表层(0~20 cm)土用于土壤理化性质分析. 将采集的表层土自然风干后研磨并过100目(0.149 mm)筛，土壤基本性质如下：有机质含量为7.0%、pH (H2O)为6.47、有效Si含量为29.0 mg/kg，有效As含量为6.90 mg/kg，总Fe含量为32.51 g/kg，总As含量为50.0 mg/kg. 所用商品硅肥由鞍山市农业产业化重点龙头企业提供，其中SiO2含量≥35%，CaO含量≥40%，MgO含量≥8%，ZnO含量≥0.5%. 富硅稻壳灰(Si-ash)制备方法参照专利“一种稻壳灰低温碳化炉(202220547798.1)”.

1.2 田间试验设置

于2020年7月23日−10月21日开展田间试验，稻田机械翻耕之后，将水稻田分为9个3 m×4 m的试验方格(见图1). 基肥施用量依照当地施肥惯例，即水稻生长全程需要50 kg复合肥/亩，氮(N)、磷(P2O2)、钾(K2O)复合肥配比为18∶8∶16，基肥的施用量占全程施肥总量的40%，基肥与土壤混合并稳定24 h后，为验证富硅稻壳灰对水稻吸收As的减控效果以及对比富硅稻壳灰与商品硅肥的有效性，分别设置3个处理：①对照组；②施加商品硅肥(Silicon)，施加比例为0.11%；③施加富硅稻壳灰(Si-ash)，施加比例为0.2%，以保证试验组添加到土壤中的Si基本保持一致. 以上每个处理均包含3次重复. 水稻移栽后第7天追施肥料的量占全程施肥总量的50%，剩余10%在秧苗移栽后的第27天施加. 具体试验进程见表1.

表 1 2020年大田试验主要农艺步骤Table 1 Major agronomic measures involved in rice cultivation in the test field in 2020

图 1 试验田现场Fig.1 Picture of experimental field

1.3 指标分析

供试土壤pH测定方法：用超纯水1∶2.5(m/V)振荡5 min后静置30 min，用ORP去极化自动分析仪(FJA-6，南京传滴仪器设备有限公司)测量pH. 对于土壤总As总量，参考美国环境保护局的标准方法(US EPA3051A)消解样品，用液相色谱-原子荧光光谱仪(LC-AFS6500，北京海光仪器有限公司)测定. 具体步骤：取0.25 g研磨过筛后的样品，加入9 mL浓硝酸和3 mL浓盐酸，于微波消解仪(CEM MARS6，Matthews，美国)中进行消解，混合物20 min内加热至180 ℃，保持20 min后冷却30 min，再利用LC-AFS分析总As总量. 水稻秧苗移栽后，将孔隙水采集器(MOM-19.21.21F，Rhizosphere Research Products，荷兰)沿着水稻根系斜45°插入土壤中，每隔10 d采集一次孔隙水以监测土壤溶液的理化状况. 利用紫外-可见光分光光度计(EvolutionTM260 Bio，Thermos Scientific，美国)测定孔隙水中Si、Fe、Fe(Ⅱ)的浓度，用LC-AFS测定As浓度.

水稻成熟后将附着于水稻根系上的根际土仔细剥离，自然风干后研磨过100目(0.149 mm)筛. 用乙酸(0.5 mol/L)和KH2PO4(0.5 mol/L)提取根际土中有效态Si和有效态As，分别利用紫外-可见光分光光度计和LC-AFS测定二者含量. 水稻根际土中As形态根据Wenzel等[20]所建立的土壤As赋存形态分级提取法进行提取分析(见表2). 土壤As形态包括非专性吸附态As(As-F1)、专性吸附态As(As-F2)、定型和弱结晶水合铁铝氧化物结合态As(As-F3)、结晶水合铁铝氧化物结合态As(As-F4).

将水稻根系彻底清洗后，利用连二亚硫酸钠-柠檬酸钠-碳酸氢钠(DCB)法提取水稻根系表面的铁膜[21]，将适量的新鲜根系剪碎后置于离心管中，加入40 mL DCB浸提液(0.06 mol/L连二亚硫酸钠、0.03 mol/L二水合柠檬酸三钠与0.125 mol/L碳酸氢钠)，用玻璃棒搅拌均匀后静置30 min，在提取过程中，水稻根系由棕色或红褐色不断转变为白色，提取完成后，将浸提液用0.45 μm滤膜过滤，利用LC-AFS测定根表铁膜的As含量(DCB-As)，利用原子吸收分光光度计(Aanalyst 900T，Peekin Elmer，美国)测定根表铁膜的Fe含量(DCB-Fe)，利用紫外-可见光分光光度计测定根表铁膜的Si含量(DCB-Si). 将提取根表铁膜后的白根烘干至恒质量，消解后测定Si和As含量.

表 2 土壤As形态的分级提取Table 2 The sequential extraction procedure for soil As

将水稻地上部清洗后在105 ℃下杀青30 min，然后在65 ℃的烘箱中保持72 h以达到水稻样品的恒质量. 将烘干的水稻样品粉碎，根据美国环境保护局的标准方法(US EPA3051A)添加HNO3/HCl通过高通量高压微波消解系统进行微波消解. 将得到的消解液在0.45 μm的滤膜过滤定容后通过LC-AFS进行总As分析. 对于植物体Si含量的测定，根据Syu等[22]提供的方法消解，具体步骤：0.05 g研磨后的水稻样品加入3 mL 50% NaOH和2 mL 30% H2O2，然后置于微波消解仪中进行消解，5 min内升温到100 ℃后保持5 min，接着在10 min之内升温到175 ℃并保持20 min，冷却后用去离子水稀释并用紫外-可见分光光度计测定Si含量. 对于精米中As形态的分析，使用1% HNO3作为萃取剂，使用微波消解仪进行温和提取. 具体步骤：烘至恒质量的水稻精米样品，研磨过100目筛后取0.25 g置于微波消解罐中，加入10 mL 1% HNO3并静置过夜，然后置于微波消解仪中进行消解，首先在5 min内温度升至55 ℃并保持10 min，然后在5 min内升至75 ℃并保持10 min，最后升至95 ℃并保持30 min. 消解液冷却至室温后，用0.22 μm的滤膜过滤获得上清液，利用LC-AFS测定无机As和有机As含量[23].

1.4 质量控制和数据分析

各处理均设置3个平行样. 样品消解插入空白样、标准土样和标准米样(国家标准研究中心)各一个.样品测试阶段中标准曲线拟合度R2≥0.999，按一定间隔插入标准液. 分别利用Origin 2018和SPSS 22.0软件进行数据处理制图、差异显著性分析和皮尔逊相关性分析，显著性分析采用ANOVA(方差分析)，组间比较采用Duncan′s test(邓肯检验)进行分析处理，P<0.05为差异有统计学意义.

图 2 商品硅肥和富硅稻壳灰处理对水稻生长期孔隙水中Si、As、Fe和Fe(Ⅱ)浓度的影响Fig.2 Effects of Silicon and Si-ash on the concentrations of porewater Si, As, Fe and Fe(Ⅱ) over the growth period of rice

2 结果与讨论

2.1 富硅稻壳灰对土壤孔隙水的影响

在水稻的生长阶段内，土壤中添加商品硅肥和富硅稻壳灰使土壤溶液中Si浓度较对照组分别提高了131.5%和866.0%(见图2)，表明商品硅肥和富硅稻壳灰都为水稻的生长提供了可利用的水溶态Si. 但是富硅稻壳灰供应孔隙水的Si优于商品硅肥，这是由于商品硅肥处理中施加的是速溶硅肥，作用时效短且容易流失，在水稻生长需大量Si供应的时期商品硅肥已无法提供足量的有效态Si. 同时富硅稻壳灰与硅酸盐枸溶性硅肥相比同样具有明显的优势，硅酸盐枸溶性硅肥施入土壤后极易被有机物和矿物质吸附，难以溶解，植物利用性很低[24]. 相比之下，稻壳在经明火燃烧以后，其外表面坚硬无孔的SiO2致密沉积被破坏，形成外部区域存在较高浓度无定型SiO2的稻壳灰，可溶性和生物可利用性均明显升高[25].

在水稻生长过程中，与对照组相比，土壤中添加商品硅肥和富硅稻壳灰使土壤溶液中As浓度分别减少了40.4%和20.3%(见图2)，这主要是由于在土壤中添加富硅稻壳灰后，富硅稻壳灰的碱性性质(pH=7.46)使土壤pH随之升高，从而促进铁氧化物的沉淀，这一过程中由于铁氧化物的还原溶解而释放的As重新被固持. 同时，富硅稻壳灰处理使土壤溶液中Fe和Fe(Ⅱ)浓度(见图2)较对照组分别降低了40.8%和26.6%，这也证实了上述分析结果. 根据Seyfferth等[26]的研究，富硅稻壳掺入土壤中会使孔隙水中Si浓度升高为对照组的2~10倍，但是孔隙水中As浓度升高为对照组的1.8~6.0倍. 其原因是，As(Ⅲ)的解离常数(pKa=9.2)与硅酸(pKa=9.8)相似，稻壳在掺入土壤后，Si与As竞争土壤吸附位点，导致大量As解吸到孔隙水中. 上述结果与孔隙水中As浓度的结果相反，这是因为稻壳的pH相比于燃烧后的稻壳灰较低，在将As从土壤中解吸之后，无法发挥碱性作用来控制As浓度在孔隙水中的升高，而富硅稻壳灰的碱性作用可以使游离的As重新沉淀到土壤，从而降低了富硅材料加入导致的孔隙水中As浓度升高对水稻生长发育的负面影响，同时也降低了籽粒中As含量增加的风险. 与稻壳相比，稻壳灰不仅在可溶性Si含量上更胜一筹[27]，同时其碱性作用也可控制孔隙水中As浓度的增加，所以富硅稻壳灰是一种更为有效的阻控材料.

2.2 富硅稻壳灰对水稻根际土的影响

与对照组相比，商品硅肥和富硅稻壳灰处理使水稻根际土中As-F1含量分别增加了23.0%和27.9%，As-F2含量分别增加了8.1%和10.6%，As-F4含量则分别降低了52.2%和44.2%(见图3)，表明在水稻土壤中添加任何形式的Si均会增加根际土As的植物利用性. 为了进一步验证上述结果，利用乙酸和KH2PO4分别提取水稻根际土中的有效态Si和有效态As. 与对照组相比，富硅稻壳灰处理使水稻根际土中有效态Si、有效态As含量分别增加了33.8%、7.3%(见表3).虽然施Si增加了As的有效性，然而富硅稻壳灰使得水稻籽粒中的无机As浓度显著下降，这是由于富硅稻壳灰的添加使孔隙水中的Si浓度相对较高，这时Si和As发生竞争吸收，植物在主动吸收矿质元素时，大量的Si优先占用转运通道Lsi1和Lsi2，抑制As进入植物体内. 这种竞争性机制有效地抑制了水稻对As的吸收，并且只有溶解相更丰富的Si材料才能将这种机制在最大程度上发挥作用. 所以在施Si的同时必须保证足够的施加量和提高Si的溶解性，才能抵御施Si带来的土壤根际土As的生物有效性的负面影响.

图 4 DCB提取根表铁膜 As、Fe和Si的含量以及DCB-As与DCB-Fe含量的相关性Fig.4 DCB-extractable As, Fe, and Si from root Fe plaque, and the correlation of DCB-As with DCB-Fe

表 3 商品硅肥和富硅稻壳灰处理对水稻根际土有效态Si、有效态As含量的影响Table 3 Effects of Silicon and Si-ash on the concentrations of available Si and available As in rice rhizosphere soil

图 3 不同处理对水稻收获后根际土As形态的影响Fig.3 The changes in soil As fraction upon rice harvest for plants grown in different treatments

2.3 富硅稻壳灰对根系铁膜吸附As的影响

与对照组相比，商品硅肥的添加使DCB-Fe的含量和DCB-As的含量分别提高了20.6%和27.1%，富硅稻壳灰的添加使DCB-Fe和DCB-As含量分别增加了47.3%和41.0%(见图4)，皮尔逊相关性分析显示，DCB-Fe与DCB-As含量呈显著正相关(见图4). 这是由于土壤中施Si有助于水稻形成更强的通气组织，促进更多的气体交换(如氧气扩散)，从而增加水稻根际铁的氧化，进而固持更多的As[28]. 同时，Si的施加可以阻止水铁矿向更高有序相的转变[29-30]，相对于更多结晶铁氧化物而言，水铁矿具有较高的比表面积，因此对As具有很强的吸附能力[31-32]. 根表铁膜对As的固持作用是限制As向植物地上组织转运的关键[33-34]，富硅稻壳灰通过促进铁膜的形成并且阻止水铁矿的相态转变有效地减少了As向水稻地上部的转运[35].与DCB-As相反，商品硅肥和富硅稻壳灰处理使DCB-Si含量较对照组分别降低了45.2%和35.5%，这主要是由于Si的添加使土壤吸附的As大量解吸，游离的As与根表铁膜上的Si竞争位点，从而导致DCB-As含量的增加和DCB-Si含量的下降，支持这一分析结果的是商品硅肥和富硅稻壳灰处理中孔隙水中Si浓度较对照组有所上升，特别是富硅稻壳灰处理的孔隙水中Si浓度显著高于对照组. Wang等[25]发现，富硅稻壳灰使DCB-Si浓度较对照组显著增加了248.0%，这与笔者所得结论相反；此外，上述研究中DCB-As含量也显著增加，这是由于富硅稻壳灰的添加比例为1%，而笔者的添加比例仅为0.2%，富硅稻壳灰添加量的上升为水稻生长提供足量Si的同时，也使得Si与As在根表铁膜竞争吸附位点时Si占据主导作用，表现出Si处理下DCB-Si浓度显著增加，而该文中富硅稻壳灰添加量较少导致可利用Si也较少，有限的孔隙水Si可能被用来下调Si转运蛋白Lsi1和Lsi2的表达[36]，较少或无法参与As在根表铁膜的竞争[37]. 所以适当提高富硅稻壳灰的添加量不仅可以增强根表铁膜对As的固持能力，同时也可以加强Si在与As竞争时的主导作用，在以后的实际应用推广中应寻找更为合理的添加比例.

2.4 富硅稻壳灰对水稻地上组织As和Si含量的影响

与对照组相比，商品硅肥和富硅稻壳灰处理中水稻白根As含量并没有显著变化，仅表现出上升趋势，同时，富硅稻壳灰处理中水稻茎叶As含量也没有显著变化，仅表现出下降趋势，然而，土壤施加富硅稻壳灰后，稻壳中的As含量降低了49.0%(见图5)，进一步分析，由茎叶向白根的As转移系数有所下降(由0.02降至0.01)(见表4)，这说明富硅稻壳灰的施加可能增强了As在白根中的持留作用，从而减缓了As向地上部的转运，但是由于大田中富硅稻壳灰的施加量较少，并没有达到显著变化的水平.

与对照组相比，富硅稻壳灰处理使得白根中的Si含量下降了14.9%(见图5)；富硅稻壳灰处理使茎叶Si和稻壳Si与对照组相比分别显著增加了69.2%和58.0%，而商品硅肥处理与对照组相比无显著性变化，这是由于富硅稻壳灰提供了更充足的可溶性Si，进一步分析得到Si的转移系数由1.29升至2.58(见表4)，表明Si和As的竞争作用有效抑制了As从根系地上部的转运，这也为富硅稻壳灰处理降低水稻中无机As提供了可能性.

表 4 Si和As从白根向茎叶的转移系数(TF)Table 4 Translocation factor (TF) of Si and As from straw to white root

图 5 不同处理下水稻地上组织中As和Si的含量Fig.5 The concentration of rice plants As and Si for plants grown in different treatments

2.5 富硅稻壳灰对谷物As形态的影响

与对照组相比，土壤中施加富硅稻壳灰使稻米无机As含量下降了29.1%(见图6)，低于GB 2762−2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》的标准值(0.2 mg/kg)，这为实现重金属As超标土壤的安全生产利用提供了可能. 籽粒无机As含量的降低与富硅稻壳灰为水稻生长提供充足的可溶性Si密切相关.可溶性Si含量的增加将从以下三方面控制籽粒无机As含量：①土壤中施加富硅稻壳灰为水稻生长供应充足的生物可利用性Si，下调了水稻根系中转运Si的水通道蛋白Lsi1和Lsi2的表达，从而限制了As(Ⅲ)在水稻根系中的吸收. ②充足的生物可利用性Si增强了Si与As的竞争吸收，足量的Si将优先占据有限的转运通道，从而减少As的吸收. ③高生物可利用性Si促进了水稻根系铁膜的形成，同时阻止水铁矿向结晶态转化，在根系固持大量As，减少As向地上部的转移(见图6).

与对照组相比，富硅稻壳灰处理下水稻精米中有机As(organic As，oAs)形态的比例增加了50.6%(见图6). 研究表明，水稻缺乏将无机As甲基化的能力，As甲基化是在植物吸收之前发生在土壤中的微生物介导的过程[38-39]. 而根据Jia等[40]的发现，施Si增加了表达As甲基转移酶基因ArsM的土壤微生物的活性. 有机As被根系吸收后在水稻内的转移比无机As更具移动性，特别是在水稻节点处只对As(Ⅲ)起到过滤作用，有机As将直接被转运到水稻籽粒中[41-42].

图 6 不同处理下谷物As含量的变化以及富硅稻壳灰对水稻吸收As的调控作用机理Fig.6 Changes in the concentrations of grain As for plants grown in different treatments, and mechanism of using Si-ash to regulation As uptake by rice

3 结论

a) 与对照组相比，施用富硅稻壳灰大幅增加了水稻孔隙水中Si浓度，使孔隙水中As浓度降低了20.3%.同时通过促进根表DCB-Fe的含量，增加了水稻根表铁膜对As的吸附.

b) 施用富硅稻壳灰增加了水稻白根对As的固定，通过降低水稻Si转运蛋白Lsi1和Lsi2表达量，抑制As向地上部组织转运，使水稻对As的转移系数从0.02降至0.01.

c) 施用富硅稻壳灰使精米无机As含量降低了29.1%，低于GB 2762−2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》的标准值(0.2 mg/kg)，实现了As污染土壤中水稻的安全生产利用. 然而，精米中有机As含量增加了50.6%，这将提高水稻患“直头病”的风险，因此，在添加富硅稻壳灰降低精米无机As含量的同时应当寻找更合理的添加量，以减少富硅稻壳灰对水稻生长产生的负面影响.