KGM组方抗炎抗过敏药效评价及作用机制的网络药理学预测

兀琦，宋书祎，陈启梅，袁晓庆，刘其耸，尹雷，杨爱琳*，张加余*

(1.滨州医学院,山东 烟台 264003;2.烟台新时代健康产业有限公司,山东 烟台 265505)

过敏性疾病是由机体受到抗原刺激引起组织损伤或功能紊乱的病理性免疫反应，临床常见包括过敏性哮喘、特应性皮炎(过敏性皮炎)、过敏性鼻炎和过敏性肠炎等[1-2]。目前，全球共逾3亿人患有过敏性哮喘。新近发表在《The Lancet》杂志上的一份流行病学研究报道显示，我国20岁及以上罹患过敏性哮喘的患者已达4 570万人[3]。因其反复发作和难以根治的特点，过敏性疾病已成为世界性健康问题。

目前，过敏性疾病的主要防治方式包括润肤、避免接触过敏原、外用激素或钙调神经磷酸酶抑制剂进行抗炎等，严重者可采用射线疗法或系统免疫抑制剂。这些治疗方式无法根治疾病，且长期使用会引发耐药性、毛细血管扩张、皮肤变薄、萎缩等不良反应[4-5]。如何真正控制过敏性疾病进程从而实现有效治疗、改善过敏体质、减少疾病复发成为令人关注的问题。本课题组研制的抗过敏组方KGM由半乳糖、甘露糖、低聚甘露糖、葡萄糖及赤藓糖醇5种糖类组成。本文基于透明质酸酶活性检测及小鼠耳郭肿胀动物模型系统评价KGM的抗炎抗过敏作用，并通过网络药理学探讨其起效机制，以期为开发具有抗炎抗过敏产品提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料 KGM(烟台新时代健康产业有限公司生产)；透明质酸酶(上海麦克林生化科技有限公司)；冰醋酸、醋酸钠、乙酰丙酮、无水乙醇、二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)；盐酸(沈阳市新光化工试剂厂)；无水氯化钙(天津市巴斯夫化工有限公司)；Chemdraw 19.0(美国Cambridge Soft公司)，所用数据库名称及其网址见表1。

表1 网络药理学研究采用的数据库

1.2 仪器 SpectraMAX M2多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；6mm直径打耳器(上海博睿达公司)；HH-8数显恒温水浴锅(常州德科仪器制造有限公司)；AUW120D电子分析天平(日本岛津公司)。

2 实验方法

2.1 透明质酸酶抑制率试验

2.1.1 溶液配制 Buffer：溶液A(0.2 mol·L-1醋酸:11.55 mL冰醋酸溶于1 L蒸馏水中)4.8 mL，溶液B(0.2 mol·L-1醋酸钠：16.4 g无水醋酸钠或27.2 g三水合醋酸钠溶于1 L蒸馏水中)45.2 mL，混合稀释至100 mL，配制成pH为5.6的醋酸缓冲液；将透明质酸酶和透明质酸钠均溶于醋酸缓冲液，使终浓度分别为500 U·mL-1和0.5 mg·mL-1；乙酰丙酮溶液：50 mL 1.0 mol·L-1碳酸钠溶液和3.5 mL乙酰丙酮溶液混合均匀；P-DAB显色剂：0.8 g对二甲氨基苯甲醛溶于15 mL浓盐酸和15 mL无水乙醇混合均匀；氯化钙溶液(CaCl2)：2.5 mol·L-1；氢氧化钠溶液(NaOH)：5 mol·L-1；样品浓度：125 mg·mL-1。

2.1.2 操作方法 A管：将0.5 mL的样品液加入0.5 mL透明质酸酶中；B管：将0.5 mL的样品液加入0.5 mL醋酸缓冲液中；C管：将0.5 mL的透明质酸酶加入0.5 mL醋酸缓冲液中；D管：0.5 mL醋酸缓冲液。37 ℃保温20 min。每管分别加入CaCl2溶液0.1 mL，37 ℃保温20 min。每管分别加入透明质酸钠0.5 mL，并在D管中加入醋酸缓冲液0.5 mL，37 ℃保温40 min，之后放置室温10 min。每管分别加入蒸馏水0.5 mL，NaOH溶液0.1 mL，乙酰丙酮溶液0.5 mL，沸水浴15 min，冰浴10 min，放置室温10 min。每管加入P-DAB显色剂1 mL，各管充分振荡后加无水乙醇至8 mL，每管设置5个重复，放置室温30 min后于530 nm处测定吸光值(A)。

透明质酸酶抑制率(%)=[(C-D)-(A-B)]/(C-D)×100%

式中：A：试样溶液(透明质酸酶+样品+透明质酸钠)的OD值；B：试样空白(醋酸缓冲液+样品+透明质酸钠)的OD值；C：对照溶液(透明质酸酶+醋酸缓冲液+透明质酸钠)的OD值；D：对照空白(醋酸缓冲液+醋酸缓冲液+透明质酸钠)的OD值。

2.2 二甲苯诱导小鼠耳肿胀试验 取昆明小鼠10只，雌雄各半，随机分为A、B两组，每组5只。A组小鼠于右耳涂抹蒸馏水作为对照，B组小鼠右耳涂抹药物，每天1次，连续3 d。B组小鼠右耳涂抹药物。末次给药30 min后，分别精密吸取二甲苯20 μL均匀涂抹于A、B两组各鼠右耳上前后两面。保持30 min，后处死小鼠，沿耳郭基线剪下两耳，采用6 mm直径打孔器于左右耳对称部位打下耳片。用精密电子天平称取各鼠耳质量，计算小鼠耳郭肿胀度和小鼠耳肿胀抑制率。小鼠的耳郭肿胀度=右耳片质量-左耳片质量；小鼠耳肿胀抑制率=(模型对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型对照组肿胀度×100%。

2.3 网络药理学分析

2.3.1 KGM作用靶点搜集 基于PubChem数据库，分别输入KGM(半乳糖、甘露糖、低聚甘露糖、葡萄糖及赤藓糖醇)英文名得到相关成分的Canonical SMILESS，将其输入Swiss Target Prediction数据库网站搜索得到成分作用靶点信息。

2.3.2 炎症、过敏和免疫相关作用靶点的筛选与预测 炎症、过敏、免疫相关靶点的筛选通过GeneCards(http://www.genecards.org/)数据库搜索与免疫、炎症及过敏关联的所有受体及基因信息，通过绘制韦恩图得到KGM和疾病共同靶点。将成分-靶点-疾病的相关信息整理成Excel表格，导入Cytoscape 3.7.1软件构建成分-靶点-疾病网络图。

2.3.3 基因功能与通路分析 使用Metascape(http://metascape.org/)数据库对KGM作用于炎症、过敏及免疫的相关靶点进行Gene Ontology(GO)分析，设定物种为homo sapiens，阈值P<0.01，筛选前20条生物过程。同时，对KGM作用于炎症、过敏及免疫的相关靶点进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析，设定物种为homo sapiens，阈值P<0.01，并筛选前20条通路。

2.4 统计与分析 应用SPSS 26.0软件进行数据统计与分析，实验结果用“均值±标准差”表示，每组至少重复5次，组间数据采用方差分析。

3 实验结果

3.1 透明质酸酶抑制率试验 具体数值如表2所示。当产品浓度为125 mg·mL-1时，KGM对透明质酸酶的抑制率为41%。当30%≤药物对透明质酸酶的抑制率<50%被评价为一般抗过敏作用[6]。由此可见KGM具有一般抗过敏作用。

表2 透明质酸酶抑制率试验结果(530 nm)

3.2 二甲苯诱导小鼠耳肿胀试验 试验研究结果如表3所示。模型对照组平均肿胀度为0.008 18 g，给药组平均肿胀度为0.004 568 g，小鼠耳肿胀抑制率约为44%，说明KGM可明显降低二甲苯所致小鼠耳朵肿胀程度，差异具有极显著的统计学意义(P<0.01)。上述结果表明KGM具有较好的抗炎作用。

表3 各组小鼠耳郭肿胀度(n=5)

3.3 网络药理学分析

3.3.1 KGM作用靶点搜集结果 通过Swiss Target Prediction数据库网站对KGM作用靶点进行搜集，得到葡萄糖作用靶点84个，低聚甘露糖作用靶点100个，甘露糖作用靶点84个，半乳糖作用靶点93个，赤藓糖醇作用靶点31个，删除重复靶点，共得到219个潜在作用靶点。

3.3.2 炎症、过敏和免疫相关作用靶点的筛选与预测 在GeneCards数据库中输入关键词immunity，allergy及inflammation检索到与免疫相关的靶点16 662个、5 018个、10 868个，删除重复基因共得到19 212个共同靶点，取成分-疾病靶点交集部分，整合得到KGM对过敏、炎症及免疫的潜在作用靶点209个(见图1)。将成分-靶点-疾病的相关信息整理成Excel表格，导入Cytoscape 3.7.1软件构建成分-靶点-疾病网络图(见图2)。

3.3.3 基因功能与通路分析 基于Metascape(http://metascape.org/)数据库对KGM作用于炎症、过敏及免疫的相关靶点进行GO和KEGG富集分析，设定物种为人，并筛选前20条生物过程或通路。

图1 成分-疾病靶点交集韦恩图

图2 成分-靶点-疾病网络图

GO富集分析(见图3)结果显示，相关靶点功能主要涉及腺苷酸环化酶调节G蛋白偶联受体信号通路反应(adenylate cyclase-modulating G protein-coupled receptor signaling pathway)、系统过程调节反应(regulation of system process)、调节分泌反应(regulation of secretion)、G蛋白偶联受体信号通路，偶联环核苷酸第二信使反应(G protein-coupled receptor signaling pathway,coupled to cyclic nucleotide second messenger)、离子输运调节反应(regulation of ion transport)等。其中，G蛋白偶联受体是涉及信号转导的细胞膜受体中最大的一个家族，这类受体与G蛋白偶联介导信号传递，G蛋白即异源三聚体鸟苷酸结合蛋白，也叫GTP结合蛋白，它们参与调节免疫应答和炎症反应，免疫或炎症中的多种介质如组胺、嘌呤核苷、前列腺素等都通过G蛋白偶联受体传递信号，其在I型过敏反应的发生过程中具有重要作用[7]。

图3 预测靶点的GO富集分析结果

KEGG通路分析(见图4)结果显示，相关靶点通路主要涉及刺激神经组织中的交互(neuroactive ligand-receptor interaction)、谷氨酸能突突触通路(Glutamatergic synapse)、氮代谢(nitrogen metabolism)、胰岛素抵抗(insulin resistance)、钙离子通道(calcium signaling pathway)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)、淀粉和蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism)等。

图4 预测靶点的KEGG通路分析结果

4 讨论

KGM由5种糖类成分构成，其中包括甘露糖和低聚甘露糖。已有文献报道，甘露糖通过与透明质酸的结合而在损伤部位聚集从而抑制活化的白细胞。此外，甘露糖能够通过抑制中性粒细胞氧化爆发和诱导T淋巴细胞向Teg细胞分化进而抑制炎症反应[8]。低聚糖是将2～10个单糖分子通过糖苷键连接而成的化合物总称。研究报道低聚甘露糖通过下调促炎介质进而有效缓解葡聚糖硫酸钠所致急性结肠炎小鼠的临床症状[9]。本文通过透明质酸酶活性检测及小鼠耳郭肿胀动物试验证明KGM具有良好的抗炎抗过敏作用。

KGM成分较为复杂，应用传统“1个药物、1个基因、1种疾病”的模式很难系统地阐明KGM的潜在作用机制。网络药理学通过大数据挖掘、高通量筛选、网络分析等多种技术来揭示“药物(复方)-靶标(基因)-通路”相互作用的复杂体系，构建药物的核心靶点和药效生物网络，揭示潜在作用机制，现已成为药物研究的一种新模式[10]。在本研究中，我们通过网络药理学的方法预测了KGM的抗炎抗过敏作用靶点。预测显示KGM有219个靶点，其中与炎症、过敏和免疫相关的有209个。结合GO和KEGG富集分析结果显示GBA、AKR1B1、CASP3、VDR、CA2、CA1、CA12、CA9、ACE、FUCA1、MGAM、SI等是KGM主要作用靶点。同时，KGM主要影响3条炎症信号相关通路，分别为G蛋白偶联受体信号通路、钙离子通道、cAMP信号通路，为KGM的抗炎抗过敏机制研究提供了指导。

综上，本文评价了KGM的抗炎抗过敏活性，并基于网络药理学分析方法初步探索了KGM发挥抗炎抗过敏作用的潜在机制，可为KGM深度开发提供初步数据。