黄体酮制剂在Beagle犬体内的药动学研究

李瑞，陈颖，陈迅，张自强

(南京斯泰尔医药科技有限公司，江苏 南京 210046)

黄体酮(progesterone)又名孕酮，是由卵巢黄体分泌的一种天然孕激素，是目前临床黄体支持的首选药物[1]。内源性黄体酮可使子宫内膜从增生期转化为分泌期，从而促使子宫内膜成熟、剥落并维持月经周期。黄体酮制剂在临床常用的适应证有：黄体功能不全、预防早产、功能失调性子宫出血等。

常用的临床给药途径有口服、注射、阴道给药3种方式。黄体酮在体内的含量很低(ng级)，故采用传统的高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)法很难准确检测其体内的血药浓度，临床上常用的黄体酮含量测定多采用放射免疫法，但由于交叉免疫[2]反应使得该方法极易受到体内多种结构相似的甾体类激素影响，因此专属性略显不足。本文以醋酸甲地孕酮为内标物，血浆经乙腈沉淀处理后进行高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析，建立了快速、灵敏、易操作的LC-MS/MS[3-7]方法，并将验证后的方法应用于比较3种黄体酮制剂经肌内注射给药后在雄性Beagle犬体内的动力学预实验研究，可以为黄体酮制剂的后续临床研究提供借鉴。

1 材料

1.1 药品与试剂 黄体酮对照品(中国食品药品检定研究院，99.7%，批号：100027-201209)；醋酸甲地孕酮(中国食品药品检定研究院，99.2%，批号：1000171-201204)；黄体酮-油剂(浙江仙琚制药股份有限公司，20 mg：1 mL，批号:161102)；参比黄体酮-水剂(Prolutex，Marckyl Pharma，20 mg/0.9 mL，批号：26871)；黄体酮注射液(南京泽恒医药技术开发有限公司，20 mg：1 mL，批号：170824)；甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；甲酸为色谱级(Sigma Aldrich公司)。

1.2 仪器与设备 高效液相色谱(Agilent 1200)串联三重四级杆质谱仪(Agilent 6410)，配备ESI离子源，数据处理系统：Mass Hunter Acquisition以及Mass Hunter Qualitative工作站；CPA225D电子天平(Sartorius公司)；超纯水机(美国Millipore公司)等。

1.3 实验动物 雄性Beagle犬6只，体重：7～9 kg，购自北京玛斯实验动物有限公司，生产许可证号： SCXK(京)2016-0001；合格证编号：11400600001897，实验动物使用许可证：SYXK(苏)2016-0013。

2 方法

2.1 检测条件 液相色谱条件：Zorbax SB-C8色谱柱(2.1 mm×50 mm，3.5 μm)，流动相：0.1%甲酸∶甲醇(20∶80)，等度洗脱，流速0.4 mL·min-1，柱温为20 ℃，分析时间为4 min；进样量：5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI源)；正离子模式检测；干燥器温度：450 ℃；流量：12 L·min-1；喷雾压力：45 Psi；毛细管电压：3 500 V；检测方式：多反应离子检测(MRM)模式进行定量，用于定量分析的离子反应为m/z 315.3→97.1(黄体酮)，碎裂电压：135 V，碰撞能量：18 V，内标物m/z 385.33→267.2(醋酸甲地孕酮)，碎裂电压：135 V，碰撞能量：18 V。

2.2 溶液的配制

2.2.1 黄体酮对照品溶液 精密称取黄体酮对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成黄体酮贮备液，浓度为1 mg·mL-1，用前用50%甲醇定量稀释制成系列浓度的对照品溶液(10、20、50、100、500、1 000、5 000、10 000、20 000 ng·mL-1)，于4 ℃冰箱保存备用。

2.2.2 醋酸甲地孕酮内标溶液 精密称取醋酸甲地孕酮对照品适量，加乙腈溶解并定量稀释制成浓度约为50 ng·mL-1的溶液作为内标溶液，于4 ℃冰箱保存备用。

2.3 给药与血样采集 6只雄性Beagle犬随机分为两组，分别编为A、B两组，采用单剂量三周期交叉给药。实验分为3个阶段，第一阶段A组给予受试制剂，B组给予参比制剂-油剂；第二阶段A组给予参比制剂-油剂，B组给予受试制剂；第三阶段A组给予参比制剂-水剂，B组给予参比制剂-水剂。各阶段时间间隔为7 d，每一阶段给药剂量均为20 mg的黄体酮制剂。

每次实验前雄性Beagle犬需禁食12 h(取下喂食的食盒)，自由饮水，第二天肌内注射受试制剂和参比制剂，给药3 h后正常给水和食物。采血时间分别是给药前1 h、0.5 h、0 h和给药后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h，采集静脉血样1 mL至加有EDTA-2K+抗凝的采血管，于冰上暂存至离心，全血经8 000 r·min-1离心5 min后收集血浆，转移血浆至96孔板中，于-20 ℃保存待测。

2.4 血浆样品处理 取血浆50 μL，加入含有内标的200 μL乙腈沉淀后振荡5 min，4 000 r·min-1离心(4 ℃)10 min，取150 μL上清液转移至已加入50 μL纯水的干净96孔板中，涡旋混匀后放入自动进样器，进样(5 μL)进行分析。

2.5 统计学处理 采用软件Phoenix WinNonlin 8.0的非房室模型分析方法对测得的雄性Beagle犬给予3种黄体酮制剂后的血药浓度数据进行药动学参数的计算，计算3种黄体酮制剂的主要药动学参数，并进行描述性统计分析。描述性统计量包括平均值和标准差，通过Tmax、Cmax和AUCINF_obs评价受试制剂与两种参比黄体酮制剂的差异。

3 结果

3.1 方法学验证

3.1.1 专属性试验 取空白血浆、空白血浆加对照品以及Beagle犬给药后血浆样本，按“2.4”项下加内标处理后，进行HPLC-MS/MS分析，黄体酮保留时间为2.1 min，醋酸甲地孕酮保留时间为1.9 min。血浆中的内源性成分不干扰黄体酮和内标的测定，峰形和分离度均良好(见图1)。

3.1.2 标准曲线与定量下限试验 取空白雄性Beagle犬血浆450 μL，分别加入不同浓度的黄体酮对照品溶液50 μL，制备系列浓度血浆样品，即1、2、5、10、50、100、500、1 000、2 000 ng·mL-1的标准血浆，平行两份。按“2.4”项下方法处理，进样分析。测得黄体酮峰面积(A)及甲地孕酮峰面积(B)。以黄体酮峰面积对甲地孕酮峰面积平均值的比值(A/B)对黄体酮的血药浓度(X)作回归方程计算，测得回归方程：Y=0.000 535 9X-0.000 023 58(r=0.996 1)，线性范围为1～2 000 ng·mL-1，定量下限为1 ng·mL-1(S/N>10)。

图1 血浆中典型黄体酮以及内标的典型MRM色谱图

3.1.3 残留效应试验 在分析标准曲线最高浓度2 000 ng·mL-1血浆样品后，进样空白溶剂以考察残留效应，在待测物的出峰位置未出现明显干扰峰，表明高浓度样品不会影响随后的低浓度样品测定。

3.1.4 提取回收率与准确度试验 取空白血浆450 μL，精密加入不同浓度的黄体酮标准溶液50 μL，制备低、中、高(2、100、1 600 ng·mL-1)的血浆，每种浓度各做5份样品。按“2.4”项下方法处理，进样分析，记录峰面积，黄体酮A1和甲地孕酮B1；另配相应浓度的对照品进样得峰面积A2和B2，提取回收率(%)=A1/A2×100%；将A1/B1带入标准曲线计算血药浓度，按照准确度(%)=测得量/添加量×100%，结果见表1。

表1 血浆中黄体酮提取回收率和准确度

结果表明，提取回收率和准确度RSD均≤15%，符合生物样本测试的要求。

3.1.5 精密度试验 制备低、中、高3个浓度的血浆质控样品(2、100、1 600 ng·mL-1)各5份，在日内和日间(连续测定3 d)进行测定，记录峰面积，代入当天随行标准曲线，计算黄体酮的浓度，评估日内和日间精密度，结果表明，日内和日间精密度RSD均≤15%，符合生物样本测试的要求。

3.1.6 基质效应 分别取6只Beagle犬的空白血浆，按“2.4”项下方法处理，制备不加对照和内标的上清液，然后以此上清液制备相应浓度的低、中、高浓度血浆样品，进样分析，记录峰面积(A)，同时用流动相配制低、中、高3个浓度的样品(加内标)，得峰面积(B)，基质效应=A/B×100%。黄体酮低、中、高3个质控浓度的血浆样品基质效应分别为94.21%±5.30%、101.24%±3.55%、96.12%±4.64%，内标的基质效应为93.74%±3.67%。结果表明，本实验条件下黄体酮的测定不受基质效应的干扰。

3.1.7 样品稳定性试验 取空白血浆450 μL，精密加入黄体酮对照品溶液50 μL，制备浓度为50 ng·mL-1的质控血浆样本进行稳定性试验，反复冻、融3次后处理并测定，RSD为5.32%，-20 ℃冻存，分别于0、1、5、10、15 d测定，RSD为4.77%；室温放置8 h，分别于0、2、4、8 h测定，RSD为4.09%，自动进样器放置12 h，分别于0、2、4、8、12 h测定，RSD为2.96%。血浆样品在各条件下均稳定。

3.2 药物动力学参数计算 分别给出6只雄性Beagle犬血浆药物浓度-时间数据及曲线和每组平均值、标准差及曲线，比较受试和参比制剂的主要药动学差异。

采用软件Phoenix WinNonlin 8.0的非房室模型计算犬给药后的药代动力学参数。达峰浓度Cmax：采用实测值；达峰时间Tmax：采用实测值；药时曲线下面积AUC0～t值：采用梯形法计算；AUC0～∞=AUC0～t+Ct/ke，Ct为最后一个可测得时间点的血药浓度，ke为消除速率常数；AUMC：药物与时间乘积对时间t的积分；平均滞留时间MRT=AUMC/AUC。

给药前药物浓度如果能够检出，则将给药前三个时间点药物浓度取平均值，采用给药后实测药物浓度减去给药前药物浓度平均值的方法得到给药后的药物浓度，然后进行统计。

3.3 结果分析 采用Phoenix WinNonlin 8.0软件，按统计矩理论分别求算犬给予3种黄体酮制剂后各只犬的相关药动学参数，详见表2。

经独立样本T检验统计分析，受试制剂与参比黄体酮-油剂的AUCINF_obs无统计学差异(P>0.05)，但与参比黄体酮水剂有统计学差异(P<0.05)。受试制剂与参比黄体酮油剂的Cmax有统计学差异(P<0.05)，与参比黄体酮-水剂无统计学差异(P>0.05)。

4 讨论

本文建立了LC-MS/MS法检测了犬血浆中黄体酮的血药浓度，本法耗时短、准确度好、灵敏度高；并能有效地应用于对3种黄体酮制剂的药动学考察。实验结果表明，该方法在黄体酮血浆浓度为1～2 000 ng·mL-1范围内线性关系良好(r=0.996 1)。日内和日间精密度试验的RSD均小于15%，方法回收率为85%～115%，定量下限为1 ng·mL-1。本方法稳定，符合生物样品方法验证要求[7]。

表2 雄性Beagle犬肌内注射给予3种黄体酮制剂后血浆中黄体酮的药动学参数(n=6)

注意：*表示2A3犬给药二次，该动物未用于计算平均药动学参数；3A2犬的T1/2确定为异常值，可能由于测样的操作失误导致

通过雄性Beagle犬三周期分别单次肌内注射给予20 mg/只受试黄体酮注射液、参比黄体酮-油剂、参比黄体酮-水剂后血药动力学监测结果可知，犬体内黄体酮的达峰时间Tmax分别为(0.19±0.09)h、(1.50±1.40)h和(0.14±0.09)h；Cmax分别为(721.64±238.71)、(104.14±56.70)和(607.83±121.96)ng·mL-1；3种制剂的AUCINF_obs分别为(629.34±169.90)、(796.16±226.16)和(766.27±147.09)h·ng·mL-1。经统计学分析，受试制剂与参比黄体酮-油剂的AUCINF_obs无统计学差异(P>0.05)，但与参比黄体酮水剂有统计学差异(P<0.05)。受试制剂与参比黄体酮油剂的Cmax有统计学差异(P<0.05)，与参比黄体酮-水剂无统计学差异(P>0.05)，本预实验研究结果为后续黄体酮注射液的临床应用动力学研究提供了参考。