脑立清制剂中樟脑的检查

尹雪，焦阳，梅桂雪，徐兴燕，谭乐俊，林永强

(山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局胶类产品质量评价重点实验室，山东 济南 250101)

脑立清系列制剂包括丸剂、胶囊剂和片剂3个制剂规格，处方组成一致，仅在制剂工艺上有所区别，处方由磁石、赭石、珍珠母和冰片等十味药组成，具有平肝潜阳，醒脑安神的功效[1]。处方中冰片具有开窍醒脑、清热止痛之功效。冰片又称合成龙脑，主要是由樟脑、松节油等经化学方法合成，冰片在合成过程中会产生或残留一定量的樟脑,另外，由于冰片的不稳定性，在不得当的储存条件下，也会部分转化为樟脑[3-9]。内服樟脑会对人体的中枢神经系统以及生殖系统产生毒副作用，且有实验表明长时间摄入樟脑，其在人体内转化的代谢物蓄积也会产生一系列毒副作用[10]。因樟脑外观和气味与冰片相近，现在更有甚者人为的掺杂樟脑,给制剂带来安全性风险。

樟脑的检查对冰片药材具有重要的意义，已作为检查指标收入《中国药典》2020年版冰片药材的检查项下[1]。但是含冰片的制剂中尚未规定樟脑限量的检查。本课题组以樟脑为指标成分，对脑立清制剂中的冰片投料情况进行了研究。建立了脑立清丸(胶囊、片)中樟脑的气相色谱(GC)检查法，并结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)法对阳性样品进行确认。

1 仪器与材料

仪器：Sartorius CP225D电子天平；Agilent 7890气相色谱仪；岛津GCMS-TQ8050 NX气相-质谱联用仪。

试剂：乙酸乙酯、无水乙醇、乙醇均为色谱纯。

对照品：樟脑(北京曼哈格生物科技有限公司，批号：C0007316，纯度：99.9%)。

样品：脑立清系列制剂为2020年国家药品评价性抽验样品，涉及15家生产企业、88个生产批次(包括丸剂52批，胶囊剂34批，片剂2批)。

2 方法与结果

2.1 气相色谱条件 以Agilent HP INNOWAX(柱长：30 m，内径：0.32 mm，膜厚：0.25 μm)为色谱柱；进样口温度为240 ℃；柱温为140 ℃；检测器温度为250 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取樟脑对照品15.18 mg,置50 mL容量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀释至刻度，即得樟脑对照品溶液(浓度为0.303 3 mg·mL-1)。

2.2.2 供试品溶液的制备 脑立清丸(胶囊、片)中均以冰片原粉入药，处方中冰片所占比例为3.125%，根据《中国药典》2020年版(一部)冰片药材项下樟脑检查项的取样量计算，确定脑立清丸(胶囊、片)取样量4.8 g，最终确定供试品溶液制备方法：取脑立清丸(胶囊、片)，研细，取4.8 g(相当于冰片0.15 g)，置锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯10 mL ，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)10 min，放冷，再称定重量，用乙酸乙酯补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取处方中除冰片以外的其他药味，照处方的组成和比例制成不加冰片的阴性对照样品，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制得不含樟脑及冰片的脑立清阴性对照溶液。

2.2.4 阳性对照溶液的制备 取脑立清阴性对照样品4.65 g和含2%樟脑的冰片0.15 g作为脑立清阳性对照，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制得含樟脑的脑立清阳性对照溶液。

分别取上述对照品、供试品、阴性对照、阳性对照溶液各1 μL，注入气相色谱仪，进行测定。结果发现阴性对照未检出樟脑，阳性对照检出樟脑，说明脑立清制剂中其他药味对樟脑测定无干扰，该方法专属性良好。气相色谱图见图1。

2.3 线性关系考察 称取樟脑对照品207.30 mg,置50 mL容量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为樟脑贮备溶液(C浓度=4.141 9 mg·mL-1)。分别精密量取不同体积樟脑贮备溶液配置成浓度为0.010 4、0.051 8、0.103 0、0.517 7、1.035 5、2.071 0、4.141 9 mg·mL-1的樟脑系列对照品溶液，精密吸取上述系列对照品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，测定。以樟脑峰面积值为纵坐标，以樟脑浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果可见，樟脑浓度在0.010 4～4.141 9 mg·mL-1范围内与峰面积积分值线性关系良好，回归方程Y=875.485 762X-4.385 286,r=0.999 98。

2.4 精密度试验 吸取浓度为0.303 3 mg·mL-1的樟脑对照品溶液1 μL，注入气相色谱仪，连续进样6次进行测定。记录峰面积分别为244.6、242.5、243.1、244.3、242.4、241.1，均值为243，RSD为0.54%。结果表明，仪器精密度良好。

2.5 重复性试验 取含樟脑的脑立清阳性样品(编号：N03)，照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，平行制备6份。精密吸取上述供试品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，进行测定。计算含量分别为1.78%、1.79%、1.78%、1.80%、1.79%、1.82%，均值为1.79%，RSD为0.73%。结果表明，重复性良好。

2.6 加样回收率试验 供试品溶液的制备：取已测知含量的含樟脑的脑立清阳性样品(编号：N03)约4.8 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入樟脑对照品3 mg，照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，平行制备6份。分别精密吸取上述供试品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，进行测定。结果见表1。试验结果表明，测定方法的回收率良好。

2.7 稳定性考察 取重复性考察项下供试品溶液，分别于制备后0、3、6、12、18、24 h进样测定。记录峰面积分别为262.1、260.0、262.8、267.3、271.4、272.4，均值为266，RSD为1.94%。结果表明，樟脑在 24 h内稳定性良好，可以满足检测需要。

2.8 检测限和定量限 分别配制一个较低浓度的樟脑对照品溶液，注入气相色谱仪，观察其信噪比值(S/N)，当S/N等于3时，此时的进样量为检测限(LOD)，当S/N等于10时，此时的进样量为定量限(LOQ)。樟脑的LOD为0.52 ng，LOQ为1.04 ng。

2.9 阳性样品的气-质联用验证 采用气相色谱-质谱联用方法，对88批次脑立清样品中检测出樟脑的阳性样品进一步确证。

色谱条件：同“2.1”项下的色谱条件。

质谱条件：检测器为三重四级杆检测器，检测器电压：0.1 kV；离子源为电子轰击源(EI)，离子源温度：200 ℃；质谱传输接口温度：250 ℃；质谱检测模式为：Q3Scan。

A.樟脑对照品；B.阳性对照；C.阴性对照图1 专属性试验

表1 加样回收率考察结果

测定法：分别精密吸取气相色谱检查项下的樟脑对照品溶液、阳性对照溶液、阴性对照溶液和检出樟脑的脑立清阳性样品各1 μL，注入气相色谱-质谱联用仪，进行全扫描，记录离子碎片，将其与NIST17质谱数据库进行比对。

2.10 计算方式与限度 《中国药典》2020年版(一部)冰片药材项下规定樟脑不得过0.50%，因冰片和樟脑为挥发性成分，脑立清丸剂、胶囊剂、片剂3种制剂制备工艺不同，在制备过程中挥发性成分是否采用包和工艺、干燥温度、时间均会对脑立清制剂中挥发性成分的含量产生影响，为了更合理的检测樟脑限度，首先测定脑立清制剂中冰片(龙脑+异龙脑+樟脑)含量，以樟脑含量/冰片含量×100%进行计算，结果以不得过0.50%作为限度。

2.11 GC法样品检测结果 采用GC法对15家生产企业88个生产批次的脑立清样品进行筛查，结果10家企业72个生产批次樟脑残留量超出限度，结果见表2。

表2 88批脑立清制剂中樟脑含量

2.12 GC-MS法验证结果 采用GC-MS法对检测到樟脑的阳性样品进一步确认，结果樟脑对照品溶液与阳性对照、阳性样品中在相同保留时间出现了m/z为95、81、108、152等相同的离子碎片，并将其与数据库中樟脑进行比对，发现完全匹配，阴性对照在与樟脑对照品保留时间一致的位置上未检测到樟脑离子碎片，且与数据库比对匹配不到樟脑离子碎片，该测定结果与气相色谱方法结果一致。典型图谱见图2。

A.阳性对照;B.樟脑对照品;C.阴性对照图2 GC-MS Q3Scan离子碎片图

3 讨论

3.1 提取因素的考察 采用单因素试验对提取溶剂(乙酸乙酯、无水乙醇、乙醇)、提取方式(超声处理、涡旋震荡、静置方式)、提取时间(5、10、15、30 min)、提取溶剂用量(5、10、20 mL)进行考察，最终确定精密加入乙酸乙酯10 mL，超声提取10 min为最佳提取方案。

3.2 定量方法考察 分别采用内标法、外标法制备脑立清样品溶液，注入气相色谱仪测定，结果内标法、外标法测定樟脑含量分别为2.35%、2.32%，结果可见，内标法和外标法测得的樟脑含量无明显差别，表明本试验所用仪器灵敏度高，因此选用外标法进行测定。

3.3 检测结果的分析 对15家生产企业88个生产批次的脑立清样品进行筛查，结果10家企业72个生产批次樟脑残留量超出限度，最高者可达1.78%，问题批次占全部批次的81.8%。针对多批次制剂中存在樟脑超限的现象可能存在的原因进行分析：①冰片原料质控不严，冰片药材本身樟脑超限；②原料存储方式不当，导致冰片中部分龙脑氧化为樟脑；③丸剂的检出率高于胶囊剂，推测丸剂生产中，40 ℃干燥过程加速了龙脑氧化为樟脑的速度，各企业干燥时长差别较大，2 h到9 h不等，对冰片中龙脑的稳定性影响较大。建议企业加强冰片原料管控，优化工艺；通过建立脑立清制剂中樟脑限量标准或补充检验方法检查项，对现行标准做有益补充，以保证广大人民群众用药安全。