RNA干扰HSF1增强碘125粒子放疗裸鼠胰腺癌移植瘤敏感性的分析

龚 敏 王爱萍 王桂良 邱 萍 徐林芳 李 兴 文剑波

胰腺癌是常见的消化道肿瘤，起源于胰腺导管上皮细胞或腺泡细胞肿瘤，其侵袭能力强、恶性程度高、发病机制复杂，治疗难度大，预后差，中位生存期不到1年，整体5年生存率仅为6%[1]。手术切除是唯一可治愈早期胰腺癌的方法，对于晚期患者，患者就诊时已至中晚期，已失去手术机会，只能采用保守治疗，如放疗、化疗、免疫治疗等。碘125粒子局部植入治疗是一种新兴的治疗方案，碘125粒子能释放大量的 X 射线及 γ 射线，可抑制肿瘤细胞有丝分裂并破坏细胞核的 DNA 及产生氧自由基持续性杀灭肿瘤细胞[2]。但是在癌组织接受放疗时，会产生放疗抵抗，HSF1是和应激相关的一个非常重要的转录因子，在胰腺癌组织中，通过DNA修复、调节细胞周期、调节能量代谢、调节细胞凋亡和自噬等途径，促进放疗抵抗[3]。本实验采用小干扰RNA(small RNA interference，siRNA)沉默 PANC-1 细胞的HSF1基因，建立移植瘤模型，探讨HSF1与胰腺癌放疗抵抗的关系及沉默HSF1与胰腺癌放疗敏感性之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和主要试剂 胰腺癌PANC-1 细胞系购自美国ATCC公司。HSF1抗体购自美国Abcam公司，碘125粒子(粒子活度为0.6mCi) 购自原子高科股份有限公司，TUNEL试剂盒购自瑞士Roche公司，Trizol试剂自美国Invitrogen公司，PCR反转录试剂盒和Taq聚合酶购自日本TaKaRa公司。Realtime-PCR扩增基因引物序列见表1，由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 各基因的引物序列

1.1.2 动物 本实验符合国家有关实验动物保护规范和管理条例，经本院伦理委员会审批。BALB/c-nu裸鼠(5～6周龄，体重18～22 g)购自江西中医药大学动物部[许可证号SYXK(赣)2008-2006)]，饲养于恒定温度(22 ℃～25 ℃)的无菌层流动物房内SPF环境。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠成瘤 取空白细胞和干扰HSF1的PANC-1 细胞进行实验，制成单细胞悬液，用DMEM培养液调细胞悬液为 1×106个/100 μL，每只裸鼠前腋下皮下接种细胞悬液200 μL，待肿瘤直径达 0.8～1 cm时继续下一步实验。

1.2.2 胰腺癌细胞移植瘤裸鼠分组及碘125粒子放疗 成瘤裸鼠随机分为4组：空白细胞组；ShRNA-HSF1组；空白细胞+碘125粒子组；ShRNA-HSF1+碘125粒子组；每组4只。碘125粒子植入裸鼠方法：乙醚吸入麻醉，碘伏消毒肿瘤局部和周围皮肤，18 G穿刺针在距肿瘤边缘1 cm处穿刺皮肤，皮下潜行进入肿瘤组织中央，退出针芯，然后将一粒碘125粒子置入穿刺针，改用圆头针芯后将碘125粒子推入瘤体中央。20 天后处死裸鼠，取瘤体，计算体积，称重。体积=0.52×长径×短径×短径；抑瘤率=[(对照组平均瘤重-碘125组平均瘤重) /对照组平均瘤重]×100%。

1.2.3 病理组织学观察 仔细完整剥离肿瘤组织，去除边缘结缔组织，生理盐水清洗瘤体表面，滤纸吸干水分，以10%福尔马林固定,石蜡包埋制片，苏木精-伊红染色，在光学显微镜下400倍观察肿瘤细胞形态学变化并拍照。观察各组肿瘤瘤体内坏死区域的大小,按坏死面积所占瘤体面积比例评分。评分标准：根据组织结构的破坏和细胞空泡化，水肿，出血和坏死，坏死分级，1分：1%～25%；2分：25%～50%；3分：50%～75%；4分：75%～100%。

1.2.4 TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡情况 肿瘤组织切片、脱蜡至水，使用20 μg/ml蛋白酶K对切片通透，37 ℃孵育30 min；磷酸盐平衡盐水清洗，将切片浸入3%过氧化氢封闭液室温封闭10 min；磷酸盐平衡盐水清洗后，置于湿盒37 ℃孵育末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase,TdT)反应液60 min；磷酸盐平衡盐水清洗，孵育生物素-辣根过氧化物酶工作液，37 ℃避光反应30 min；DAB工作液显色后，苏木精复染细胞核；晾干后中性树脂封片。使用光显微镜随机选取5个视野(×400)观察肿瘤组织中细胞凋亡情况。细胞中显示绿色颗粒为阳性表达，使用Motic 6.0图像分析系统进行统计分析，凋亡指数(AI)%=[凋亡细胞数/肿瘤细胞总数]×100%。

1.2.5 Real-time PCR检测mRNA表达 取80～100 μg组织，Trizol法提取RNA，反转录成cDNA。PCR引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 配制20 μL的多聚酶链反应体系：加入上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL SYBR Enzyme 10 μL，cDNA1 μL，无酶水8 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃延伸1 min，共40个循环。GAPDH作为内参，逆转录聚合酶链式反应扩增，分析各基因的表达水平。2-ΔΔCt法分析表达数据 (标准化至内部对照水平后)。

1.2.6 Western blot 免疫印迹法检测蛋白表达 取80～100 μg组织，提取组织总蛋白，以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶电泳1 h，使用转移电泳装置，在4 ℃、300 mA恒流条件下电转150 min，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。 用含5%脱脂牛奶的TBST 溶液室温封闭1 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min，加入荧光二抗，室温避光孵育1 h，洗膜后滴加适量混匀的超灵敏化学发光 (enhanced chemiluminescence，ECL)液，放置在化学显色仪中进行曝光显像。使用Image J软件分析计算各条带灰度值，以目的蛋白与内对照GAPDH蛋白条带的比值分析目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

应用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，计数资料以百分率表示，两组之间的比较用t检验，多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSF1在空白细胞组和ShRNA-HSF1组细胞中的表达

HSF1蛋白在空白细胞组中表达较高，而在 ShRNA-HSF1组中表达较低，差异有统计学意义(图 1)。

图1 HSF1在空白细胞组和ShRNA-HSF1组细胞中的表达

2.2 各组裸鼠移植瘤体积、瘤重、抑瘤率比较

与自然生长的裸鼠移植瘤体积相比，ShRNA-HSF1组小于空白细胞组，差异有统计学意义；经碘125粒子治疗的裸鼠移植瘤体积相比，ShRNA-HSF1组小于空白细胞组，差异有统计学意义；ShRNA-HSF1组抑瘤率高于空白细胞组(表2)。

表2 各组裸鼠移植瘤体积、瘤重、抑瘤率比较

2.3 苏木精-伊红染色检测4组裸鼠移植瘤组织坏死评分

自然生长的空白细胞及ShRNA-HSF1组无明显坏死，空白细胞+碘125粒子组及ShRNA-HSF1+碘125粒子组的坏死评分增加，两者比较差异有统计学意义(表3)。

2.4 4组裸鼠移植瘤凋亡指数比较

自然生长的空白细胞组及ShRNA-HSF1组凋亡不明显，空白细胞+碘125粒子组和ShRNA-HSF1+碘125粒子组凋亡细胞增多，细胞质浓缩、染色质浓集于核膜周围，典型的凋亡小体形成。凋亡细胞分析，ShRNA-HSF1+碘125组较空白细胞+碘125组显著性增多(表4)。

表3 4组裸鼠移植瘤坏死评分比较

表4 4组裸鼠肿瘤凋亡指数情况比较

2.5 ShRNA-HSF1对凋亡相关基因Bcl2、Bax与Caspase 3 mRNA表达的影响

在自然生长条件下，与空白细胞组相比，ShRNA-HSF1能抑制Bcl2 mRNA的表达，经碘125粒子放疗后，Bcl2 mRNA表达降低，ShRNA-HSF1进一步促进Bcl2 mRNA表达降低。在自然生长条件下，与空白细胞组相比，ShRNA-HSF1能促进Bax mRNA的表达，经碘125粒子放疗后，Bax蛋白表达升高，ShRNA-HSF1进一步促进Bax mRNA表达升高。在自然生长条件下，与空白细胞组相比，ShRNA-HSF1能促进Caspase 3 mRNA的表达，经碘125粒子放疗后，Caspase 3蛋白表达升高，ShRNA-HSF1进一步促进Caspase 3 mRNA表达升高(图2)。

注：a为与空白细胞组比较，P<0.05；b为与ShRNA-HSF1组比较，P<0.05；c为与空白细胞+碘125组比较，P<0.05。

2.6 ShRNA-HSF1对凋亡相关基因Bcl2、Bax和Caspase 3蛋白表达的影响

在自然生长条件下，与空白细胞组相比，ShRNA-HSF1能抑制Bcl2蛋白的表达，经碘125粒子放疗后，Bcl2蛋白表达降低，ShRNA-HSF1进一步促进Bcl2蛋白表达降低。在自然生长条件下，与空白细胞组相比，ShRNA-HSF1能促进Bax蛋白的表达，经碘125粒子放疗后，Bax蛋白表达升高，ShRNA-HSF1进一步促进Bax蛋白表达升高。在自然生长条件下，与空白对照组相比，ShRNA-HSF1能促进Caspase 3蛋白的表达，经碘125粒子放疗后，Caspase 3蛋白表达升高，ShRNA-HSF1进一步促进Caspase 3蛋白表达升高(图3)。

注：a为与空白细胞组比较，P<0.05；b为与ShRNA-HSF1组比较，P<0.05；c为与空白细胞+碘125组比较，P<0.05。

3 讨论

胰腺癌是目前全球第七大癌症死亡原因。完全手术切除可显著延长生存期，但肿瘤通常在晚期才被诊断出来，因此只有一小部分患者适合手术治疗。由于其发病位置隐匿、早期症状不明显、无特异性标志物、影像学技术对较小的病变诊断率低，恶性程度高、手术仅能切除早期较小的肿瘤，中期及晚期的患者往往失去了手术机会，化疗、介入治疗和放疗是主要治疗方案[4]。由于体外放疗副反应大，部分患者难以接受，故碘125粒子植入内放疗成为了倍受重视的治疗方案。碘125粒子可向肿瘤组织释放 γ 射线破坏肿瘤细胞细胞膜、破坏DNA双链结构从而杀灭或抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤细胞增殖、促使凋亡和自噬而起到治疗作用，具有低剂量率、持续性电离辐射、半衰期长(59.6天)、对肿瘤局部照射剂量高、而对周围正常组织照射剂量低等优点[5]。胰腺癌的放疗后残留和复发与多种因素有关，如肿瘤的分期、大小、侵犯范围、病理类型有关，但胰腺癌细胞对放射线的抵抗亦是重要因素。而这种抵抗是通过对损伤的肿瘤细胞 DNA 进行修复实现的。放射线导致细胞 DNA 损伤，此时肿瘤细胞可以激活多种蛋白来修复损伤的 DNA，从而使肿瘤细胞存活下来，放疗停止后，肿瘤细胞可以再次增殖导致复发[6]。

在哺乳动物中，HSF1是这一古老转录程序的主要调节因子。在蛋白质毒性损伤时，热休克反应/热休克蛋白反应(HSR/HPSR)对蛋白质组内稳态或蛋白质平衡至关重要，从而抵抗应激和拮抗蛋白质错误折叠疾病和衰老，而在肿瘤细胞中HSR/HPSR具有意想不到的促癌作用。HSF1在没有压力的情况下会潜伏在原代细胞中，但在恶性细胞中会被激活。HSR/HPSR作为致癌网络的一个组成部分，几个控制HSF1通过环境应激源激活的关键途径与恶性肿瘤有因果关系。重要的是，HSF1对癌症蛋白质组有系统的影响，包括维持或促进肿瘤发生、促进肿瘤发生和恶性转化、维持蛋白稳态和阻碍细胞凋亡。多项证据表明，过表达HSF1可促进癌的发展，抑制HSF是一种有希望的抗肿瘤策略[7-10]。因此，HSF1被认为是一种有希望的癌症治疗候选靶点，而能够通过调节HSF1表达来激发抗癌活性的策略最近引起了人们的极大兴趣[11]。

本课题组前期工作发现，HSF1在胰腺癌中表达升高[12]，为了进一步探讨HSF1对胰腺癌放疗效果的影响，本研究构建了RNA干扰HSF1胰腺癌细胞株，并构建裸鼠胰腺癌移植瘤模型，采用碘125放疗，结果发现，与空白细胞组比较，ShRNA-HSF1组的体积增量比和瘤重显著性降低，抑瘤率和凋亡指数显著性升高。提示HSF1能促进肿瘤生长、参与 DNA 的损伤修复和放疗抵抗，干扰HSF1更容易受到放射线损伤。

在癌细胞中，促凋亡蛋白(如Bax、Bak及Bad等)、抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL及 Bcl-w 等)和凋亡调控因子(Caspase家族等)等相互调控诱导细胞有序性死亡[13]。通常情况下，在胞外死亡信号刺激下，细胞膜表面的死亡受体激活，促使线粒体释放细胞色素 C 至胞浆，与Caspase 9和凋亡酶激活因子 1(Apaf-1)等形成凋亡小体，进一步在三磷酸腺苷的作用下 Caspase 9 酶切并激活Caspase 3，从而介导细胞凋亡的死亡受体途径及线粒体途径并激活其他Caspase成员，启动激酶级联反应，从而促进细胞凋亡[14]。Bax和 Bcl-2 是作用互为拮抗作用的凋亡调控蛋白。正常情况下，Bax和 Bcl-2以适当比例存在，调节细胞的基本生理过程，在放疗状态下，二者的比例发生变化。 Bax 表达增多，形成的Bax/Bax 同二聚体明显增多，使线粒体膜通透性增加，细胞色素 C 释放增多，激活 Caspase 家族蛋白[15]。本研究结果发现，在自然生长条件下，ShRNA-HSF1能抑制Bcl2蛋白的表达，而促进Bax和Caspase 3蛋白的表达，经碘125粒子放疗后，Bcl2蛋白表达降低，而Bax和Caspase 3蛋白表达升高，ShRNA-HSF1进一步促进Bcl2蛋白表达降低，而进一步促进Bax和Caspase 3蛋白表达升高。由于胰腺癌的发病机制及治疗机制非常复杂，HSF1其对胰腺癌致病相关基因表达的影响，及其怎样调控放疗抵抗的进一步机制，尚需以后的实验进一步研究。

综上所述，RNA干扰HSF1能抑制胰腺癌移植瘤的生长，碘125粒子能诱导胰腺癌移植瘤凋亡，沉默HSF1能通过抑制 Bcl2 mRNA和蛋白、促进Bax和Caspase 3 mRNA和蛋白的表达而促进碘125放疗胰腺癌移植瘤的敏感性。