HPLC法测定丹参益心胶囊中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量

何元凯

文山州食品药品检验研究院，云南 文山 663099

丹参益心胶囊的现行标准为国家药品标准WS-10732(ZD-0732)-2002-2012Z，由三七、灯盏细辛、回心草、紫丹参、制何首乌、延胡索等六味药材经提取制成的复方制剂。具有活血化瘀，通络止痛，用于瘀血阻滞所致冠心病、心绞痛[1]。现行标准中含量测定项以人参皂苷Rg1的含量作为控制指标，每粒含三七以人参皂苷Rg1计，不得少于4.5 mg。

三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根茎，主含人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2和三七皂苷R1、R4等20余种皂苷成分，其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1是含量最高的成分，三七皂苷R1又是三七的特征成分。文献报道[2-7]多采用HPLC法测定其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1的含量。本文采用HPLC法同时测定丹参益心胶囊中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1三者的总量，实验结果表明该方法精密度、稳定性和重现性均能满足要求。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津2010系列高效液相色谱仪，包括控制器SCI-10Avp、检测器SPD-10Avp、泵LC-10Avp、梯度单元FCV-10Avp、柱温箱CTO-10ASvp。

1.2 材料 三七皂苷R1(批号：110745-201921)、人参皂苷Rg1(批号：110703-201933)、人参皂苷Rb1(批号：110704-202028)均购自中国食品药品检定研究院。水为重蒸馏水，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。丹参益心胶囊(云南特安呐制药股份有限公司产品，批号详见表7)。

2 方法

2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1适量，加甲醇定容，制成含三七皂苷R10.2 mg/mL、人参皂苷Rg10.5 mg/mL、人参皂苷Rb10.4 mg/mL的混合溶液，摇匀，既得。

2.2 供试品的制备 取装量差异项下的本品内容物，混匀，研细，取1g，精密称定，置锥形瓶中，加入甲醇30 mL，超声处理(功率250 W，频率 33 kHz)30 min，放冷，滤过，并用适量甲醇洗涤滤纸，收集滤液，水浴蒸干，残渣加水20 mL使溶解，转移至分液漏斗，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20 mL,合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的氨试液振摇洗涤两次，每次25 mL,弃去氨液，正丁醇液用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20 mL,弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 阴性对照溶液的制备 取不含三七的供试品(即空白样品，按丹参益心胶囊制法制备的不含三七样品，由云南特安呐制药股份有限公司提供)。再按上述供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.4 色谱条件及系统适用性试验[8]色谱柱：Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长：203 nm；流动相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(表1)；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。以分离度、峰的对称性、保留时间等为评价指标。结果表明，在此条件下，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1三者之间及与其他组分能较好地分离。如图1、图2所示。

3 含量测定

3.1 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、阴性对照溶液各20 μL，进样，记录色谱图(如图1、图3所示)。在该色谱条件下的分离效果较好，阴性样品在于对照品出峰相应的保留时间处未见明显色谱峰，表明本品中三七以外的其他成分对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的测定无干扰。

表1 流动相梯度洗脱表

1.三七皂苷R1；2.人参皂苷Rg1；3.人参皂苷Rb1

1.三七皂苷R1；2.人参皂苷Rg1；3.人参皂苷Rb1

图3 阴性对照溶液HPLC图谱

3.2 线性关系考察 精密吸取上述取混合对照品溶液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、10 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。分别精密吸取上述供试品试液各20 μL，进样，按上述色谱条件测定峰面积。以进样量(μg)为X轴，以峰面积(万)为Y轴，进行线性回归计算。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1相关系数分别为0.9999、0.9999、0.9999，线性范围分别为0.10～4.0 μg、0.25～10.0 μg、0.20～8.0 μg。见表2。

表2 线性试验结果表

3.3 精密度试验 取同一浓度对照品溶液，重复进样5次，每次20 μL，测定其峰面积，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1峰面积的RSD分别为1.2%、0.8%、0.8%(n=5)。见表3。

表3 精密度试验表

3.4 重复性试验 取同一批供试品，照研究所得方法重复测定5次，计算粒含量。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1含量的平均值分别为3.69 mg/g、15.41 mg/g、10.00 mg/g，RSD分别为2.6%、1.4%、2.3%(n=5)。见表4。

表4 重复性试验表

3.5 稳定性试验 取同一浓度供试品溶液，分别于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h进样，测定其峰面积。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1峰面积的平均值分别为1116762、6538092、2538085，RSD分别为1.9%、1.6%、1.9%(n=5)。供试品溶液在8 h内基本稳定。见表5。

表5 稳定性试验

3.6 加样回收试验 称取已知含量的本品粉末6份，每份0.8 g，置锥形瓶，分别加入混合对照品溶液(含三七皂苷R1为1.23 mg/mL、人参皂苷Rg1为3.02 mg/mL、人参皂苷Rb1为2.85 mg/mL)1 mL，照供试品溶液制备方法，至“加甲醇30 mL……”起，同法操作。精密吸取供试品溶液20 μL,测定峰面积值，计算回收率。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1的回收率分别为99.7%、99.8%、97.6%，RSD分别为1.6%、1.1%、1.1%(n=6)。见表6。

表6 回收率实验结果表

表6(续)

3.6样品测定 取装量差异相下本品，照供试品溶液配制方法，测定了10批丹参益心胶囊产品，并计算三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、和人参皂苷Rb1总含量。结果见表7。

表7 样品测定表

4 讨论

4.1 HPLC法测定 三七中皂苷类成分含量的报道较多，本研究建立的方法前处理甲醇超声提取即可，操作简单；通过方法学考察，本法准确、易重现、可操作性强；在方法学考察的基础上，共测定了10批样品，测定结果具有一定的代表性。

4.2 含量限度的拟定 《中国药典》2020年版一部中“三七”含量测定项下按干燥品计算，含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1的总量不得少于5.0%。根据其含量限度，并扣除水分计算，本品规格0.4 g/粒，以处方中1000粒投料三七1250 g，以转移率90%计算，丹参益心胶囊中3种皂苷的总量应不得少于22.5 mg/g。现行标准中仅以人参皂苷Rg1含量作为限度，不能有效控制其产品质量。该方法以3种皂苷的总量作为丹参益心胶囊的含量测定方法，有利于产品质量的控制。