基于HPLC指纹图谱结合化学计量学的风热感冒颗粒质量评价

夏鹏飞 李开斌 王晓雁 赵室梅 龙丽娜 鲍 娟

贵州省安顺市食品药品检验所，贵州 安顺 561000

风热感冒颗粒(fengre ganmao granule，FGG)是由桑叶、连翘、菊花、牛蒡子等十一味中药制成的颗粒剂，具有清热解表，宣肺利咽之功效，主要用于由感冒引起的身热、鼻塞、头痛、咳嗽、多痰等症[1]，FGG收录于卫生部中药成方制剂，标准中仅对FGG的颗粒通用检测项进行质量控制，目前有文献[2-4]报道对FGG所含绿原酸、连翘苷、牛蒡苷等成分进行定量测定的研究，尚未发现对FGG指纹图谱建立及结合化学计量学分析相关的报道，中药复方制剂具有成分多样性、复杂性、成效整体性等特点，只针对某几种成分定量测定对全面反映其整体质量仍具有局限性，本实验以中药指纹图谱结合聚类分析(HCA)方法将指纹图谱提供的信息进行再评价，多角度把中药制剂的隐藏规律表达出来，避免主观上的加权，为更加全面研究FGG整体质量提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器(DAD)、安捷伦工作站(Agilent公司)；KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XSE105型十万分之一电子天平(梅特勒托利多有限公司)。

1.2 材料 绿原酸(批号110753-201817，含量96.8%)、芦丁(批号100080-201811，含量92.4%)、连翘苷(批号110821-201816，含量95.1%)、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸(批号111782-201405，含量92.4%)和牛蒡苷(批号110819-201812，含量95.0%)均来源于中国食品药品检定研究院。色谱乙腈(Fisher公司)、水为超纯水、磷酸为分析纯。

风热感冒颗粒生产厂家及批次：贵州百灵企业集团制药股份有限公司，批号：B20200501；通化仁民药业(中大)股份有限公司，批号:200702；康县独一味生物制药有限公司，批号：2011392301；通化仁民药业(德济)股份有限公司，批号:200507；广东恒诚制药(恒诚)股份有限公司，批号:2004210；株洲千金药业股份有限公司，批号：20190801；兰州佛慈制药股份有限公司，批号：20054；云南白药集团股份有限公司，批号：ZEA2004；广东恒诚制药(南海)股份有限公司，批号：1909204；山东孔府制药股份有限公司，批号：20200103，上述10批样品按顺序编号s1～s10。

2 方法

2.1 色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温20 ℃；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0～11.0 min，10.0%～15.0%乙腈；15.0～30.0 min，15.0%～18.0%乙腈；30.0～50.0 min，18.0%～40.0%乙腈；50.0～51.0 min，40.0%～11.0%乙腈；51.0～60.0 min，10.0%乙腈；流速：1.0 mL/min；检测波长为330 nm；进样体积：10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取对照品绿原酸、芦丁、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、连翘苷、牛蒡苷各适量，用50%甲醇溶液制成浓度分别为0.2089 mg/mL、0.2122 mg/mL、0.1955 mg/mL、0.2975 mg/mL、1.4580 mg/mL的对照品储备液；精密吸取各对照品储备液2 mL至25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀释至刻度，制成浓度分别为绿原酸16.71 μg/mL、芦丁16.97 μg/mL、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸15.64 μg/mL、连翘苷23.80 μg/mL、牛蒡苷58.32 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取FGG 约10 g，研细，取5.0 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液30 mL，超声30 min，放冷，加50%甲醇溶液至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取FGG(编号S1)，按“2.2.2”方法制得供试品溶液，依法连续测定6次，选出出峰稳定、响应值高、峰面积大、分离度较好的14号峰(牛蒡苷)作为参照峰，记录色谱图。结果各共有峰相对峰面积与相对保留时间RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取FGG(编号S1)，按“2.2.2”方法制得供试品溶液，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h依法进样测定，以14号峰为参照峰，记录色谱图。结果各共有峰相对峰面积与相对保留时间RSD均小于3.0%，表明供试品溶液24 h内稳定。

2.3.3 重复性试验 取FGG(编号S1)，按“2.2.2”方法制备6份平行供试品溶液，以14号峰为参照峰，记录色谱图。结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间RSD均小于3.0%，表明该方法重复性好。

2.4 指纹图谱的建立与相关性分析

2.4.1 FGG指纹图谱的建立 取10批不同厂家次FGG，以“2.2.2”方法制备供试品溶液，按“2.1”方法测定，导入2012.130723版中药色谱指纹图谱相似度评价软件，样品S1图谱作参照图谱，以平均数法加以多点校正建立指纹图谱。色谱图如图1所示 。

图1 10批FGG HPLC指纹图谱(S1～S10)和对照指纹图谱(R)

2.4.2 FGG相似度分析 通过中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.130723版)进行比对，10批FGG指纹图谱相似度分别为0.973、0.930、0.985、0.881、0.950、0.991、0.988、0.990、0.970、0.955，范围为0.881～0.991，有8个批次的相似度大于0.95，有1个批次相似度较低为0.881，说明大部分厂家FGG质量均一，少部分存在差异。

2.4.3 主要特征峰归属 精密吸取“2.2.1”项下各对照品储备液，依法进样测定，与指纹图谱各共有峰进行指认，标示出5个色谱峰，分别为2号峰绿原酸、6 号峰芦丁、10号峰3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、13 号峰连翘酯、14号峰牛蒡苷，色谱图如图2。

图2 混合对照品色谱图

2.5 基于化学计量学的FGG质量分析 HCA是通过集合分组将类似的对象组成的多个类的分析过程，能对相似关系进行分类，对中药与中药制剂质量研究有着重要意义。本实验以峰面积与相对峰面积为变量，考察其制剂整体成分含量与组分比例情况，对10个不同批次FGG样品的测定数据，以Euclidean距离为测度采用SPSS26.0软件组间联接进行聚类分析，结果如图3 。当以样品峰面积(A样/W样)(见表2)为变量，以较大类间距离25时10批样品可聚为两类，S2、S4、S3、S5、S9、S10为第Ⅰ类,S7、S8、S1、S6为第Ⅱ类，结果表明10批FGG在成分含量上可分为差异较大的两类样本。当以相对峰面积(见表3)为变量时，以5为类间距离，10批样品可聚为3类，S3、S6、S7 、S8、S10、S5、S9为第Ⅰ类、S2为第Ⅱ类、S4为第Ⅲ类，当类间距离为10时，10批样品可聚为2类，S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S9、S10为第Ⅰ类，S4为第Ⅱ类，结果表明10批FGG在成分组成比例上具有较强的相似性。

(a)峰面积(A样/W样)为变量 (b)相对峰面积为变量

表2 10批FGG HPLC指纹图谱共有峰峰面积(A样/W样)

表2(续)

表3 10批FGG HPLC指纹图谱共有峰相对峰面积

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本实验在选择流动相系统时考察了不同比例的甲醇-水、乙腈-水[5]。结果表明，乙腈-水分离效果优于甲醇-水，通过在水相中加入的磷酸溶液[6],能改善大部分峰形，最终确定以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，峰形与分离度好。在波长选择上，参考文献报道，FGG内含多个成分在330 nm处有较好的吸收[7-8]，同时运用PDA检测器进行全波段扫描，最终选择出峰较为全面的330 nm作为检测波长。

3.2 结果分析 本实验通过建立指纹图谱对10批FGG进行相似度与HCA综合评价，指纹图谱相似度结果与当相对峰面积为变量类间距为5时HCA分类结果相一致，指纹图谱相似度评价结果数据直接明了，而HCA可通过类间距测度不同，细分程度更灵活多变，能提供可视化的聚类树状图评估样本组内外差异，直观分析其样本之间相似程度，同时HCA能引入更多变量对样本进行分析，当在HCA中引入峰面积(A样/W样)为变量时，聚类树状图显示了FGG在成分含量上存在的整体差异情况。综合数据分析结果可以得出，10批FGG虽然在组成比例上相似程度较高，但在组成含量上样品存在较大差异，可分为差异较大的两类，反映了10批FGG整体质量存在一定差异，产生的原因可能与不同厂家FGG原药材来源、采收加工、制剂生产工艺等因素有关，同时也可能存在FGG国家标准对质量控制不够全面，生产厂家存在一定主观故意性，反映FGG有必要建立一套完整、可靠、科学的质量标准体系，以使其产品质量稳定可控。中药及中药制剂发展需要质量稳定、科学的检测方法，中药及其制剂成分存在复杂多样性，目前指纹图谱的应用越发广泛，化学计量方法的运用能简化数据结构，利于分析，多方法的结合对中药质量控制评价有积极的参考意义。