紫蠊乳膏制备工艺优化及药理作用的研究

魏彬彬 骆丹妮 秦松莹 查 梦 张小飞 史亚军 邹俊波

陕西省中药基础与新药研究重点实验室/陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046

增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是创伤修复的一种必然产物，严重地影响了机体的正常功能及美观，给患者的身体和心理都带来了极大的疼痛。由于它们确切的发病原因和机制还不清楚，所以目前医学研究中并无一种具有特殊性的根治途径[1]。故从天然药物中筛选出更为安全、有效的药物治疗显得尤为迫切。

瘢痕被前人称为“黄瓜痈”“肉龟”等。从中医学角度出发，认为疤痕和外邪、正虚有极大关系，其发生的原因在于“气滞血瘀、余毒未清”，还有诸多表现如湿热内盛、气虚、血虚及阴虚等；其治疗方法通常是活血、散瘀、清热、解毒[2]。美洲大蠊是传统动物类药材中“蜚蠊”的重要基源和药材之一，传统的功效主要包括通利血脉、敛疮生肌等[3]，多用于癥瘕积聚、疮痈肿毒。由于其疗效确切，以其为主要原料的中成药在临床上广泛使用，尤其在各种创面的修复上，疗效显著。紫草的药理作用主要包括清热、凉血、解毒以及解肌透疹等。其常用于治疗疮毒溃疡、斑疹以及表皮颜色紫黑、水火及急性烧烫伤等[4]。由此可见，美洲大蠊和紫草治疗增生性瘢痕具有中医理论依据及临床应用支撑。另外，本次实验制作兔耳增生性瘢痕模型[5]，探讨紫蠊乳膏对增生性瘢痕的治疗效果，为祛瘢痕药的进一步研究提供新的思路。

1 材料

1.1 药品及主要试剂 紫草(亳州市众益堂中药材销售有限公司，批号: 20201108)；美洲大蠊干品(弥渡县云峰美蠊养殖基地，批号:20201128)；硬脂酸(山东中旺油脂有限公司，批号：SA-1801)；三乙醇胺(山东鑫隆辉化工进出口有限公司，批号:20200806)；羊毛脂(宏尚生物科技有限公司，批号:20200514)；液体石蜡(中淼石油化工有限公司，批号:20181231)；吐温-80(邢台鑫蓝科技有限公司，批号:20191008)；重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶(recombinant bovine basic fibroblast growth factor gel,RBBFGFG，珠海亿胜生物制药有限公司，批号:20201024)；磷酸氢二钠[福晨(天津)化学试剂有限公司，批号: 20200507]；中性树胶(Biosharp生物公司，批号: 70120150)；Annexin V-FITC双染试剂盒(四川川柏生物科技有限公司，批号:P-CA-202)；(ALT/GPT)ELISA试剂盒(四川川柏生物科技有限公司，批号: CR20170604)。

1.2 主要仪器 旋转蒸发仪(河南华丰仪器有限公司)；RS36型全自动染色机(常州派斯杰医疗设备有限公司)；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；数字切片扫描仪[Pannoramic 250，3DHISTECH(Hungary)]等。

2 紫蠊乳膏的制备及处方优化

2.1 紫草和美洲大蠊的提取

2.1.1 紫草的提取 由于所需的活性成分紫草素在高温下会被破坏，因此在该实验中，通过冷浸法制备紫草油。制备方法如下：将紫草切碎并浸入菜籽油中，9 d后，将药渣滤掉，剩余的紫草油可供后续实验使用。

2.1.2 美洲大蠊的提取 取200 g美洲大蠊，加10倍量90%的乙醇，回流2 h，过滤，药渣加8倍量水，提取两次，每次提取1 h，收集水提液，使用旋转蒸发仪浓缩至稠浸膏后备用。

2.2 制备 本品属于O/W型乳膏剂，处方中的硬脂酸、液状石蜡和羊毛脂均可作为乳化物的油相；紫草和美洲大蠊提取物、蒸馏水、三乙醇胺等均可以用作水相；羊毛脂作为保湿剂；尼泊金乙酯作为抗蚀性的防腐剂。如图1所示。

图1 紫蠊乳膏制备工艺流程图

2.3 处方优化

2.3.1 处方设计 紫蠊乳膏：紫草、美洲大蠊提取物适量、硬脂酸3.0、羊毛脂0.5g、 液体石蜡3.0 mL、吐温-80 1.0mL、尼泊金乙酯0.5g、三乙醇胺适量、蒸馏水适量。

2.3.2 紫蠊乳膏最佳处方筛选 预实验[6]发现处方优化中的关键是三乙醇胺的用量，所以本实验主要通过调整三乙醇胺的用量来选出紫蠊乳膏的最优处方。见表1。

表1 紫蠊乳膏处方用量

表1(续)

2.3.3 处方稳定性评价 乳膏剂的测评方法可以参考2020年版《中国药典》(四部)[7]。其评价指标主要包括：乳膏剂的外观、性状、离心稳定性、耐寒性和耐热性、pH 值等。各项考核指标的评分详见表2(满分:100分)。由3人以上对各个指标的平均得分进行叠加，作为最终的评分。

表2 各项考察指标评分表

2.3.4 处方稳定性评价结果 通过比较，可以看出，方中主要药物(紫草提取物、美洲大蠊提取物)的用量与三乙醇胺的用量在一定程度上有相关性。如表3所示，在改变两者的比例的情况下，发现在各项内容的测定结果中，处方4明显优于其他处方。因此，筛选得到的最佳处方是处方4。

表3 紫蠊乳膏稳定性试验评分

本次实验以以上五项内容为评价指标，优化了紫蠊乳膏的处方。确定其最优处方为处方4。即：紫草提取物2.5 mL(10%)，美洲大蠊提取物2.5 mL(10%)，硬脂酸3.0 g(12%)，三乙醇胺3.0 mL(12%)，羊毛脂0.5 g(2%)，液体石蜡3.0 mL(12%)，蒸馏水9.0 mL(36%)，吐温-80 1.0 mL(4%)，尼泊金乙酯0.5 g(2%)。采用该处方及相应的制备工艺可制备质地均匀细腻、性状和含量均稳定的乳膏。

3 紫蠊乳膏对兔耳瘢痕模型的影响

3.1 兔耳增生性瘢痕模型制备 依据文献复制兔耳增生性瘢痕模型[8]。在该实验中，取4只新西兰大白兔,体重介于2.0～2.5 kg之间，其中3只被固定在固定板上，并用75%的酒精对兔耳进行消毒。使用浓度为40 mg/kg的1%戊巴比妥钠溶液，从兔耳缘静脉注入，再将麻醉后的大白兔于兔耳腹侧避开血管，制作直径约为 0.8 cm的圆形创面，每只兔左右耳腹侧分别制备3个创面，各个创面的间距约1.0 cm，完整地切除各创面全层皮肤，然后将其剥离并完全刮去软骨膜，保留软骨。手术工作完毕后把兔放在笼中喂养，自由进食、饮水。

3.2 分组与给药 将新西兰大白兔随机分为4组。分别为空白组 、模型组 、紫蠊乳膏组、重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶组(简称：RBBFGFG组)。除了空白组外，其余的各组处理方法为：模型组涂抹生理盐水，紫蠊乳膏组涂抹紫蠊乳膏，RBBFGFG组涂抹阳性药。连续用药21 d后对各组瘢痕进行大体观察。

表4 兔耳增生性瘢痕治疗方案

3.4 给药期间瘢痕面积变化 说明与模型组相比，紫蠊乳膏组和RBBFGFG组创面修复较快，瘢痕面积明显减小，说明两组数据差异有显著性意义。

3.5 兔耳瘢痕对比图 由表5、表6得：紫蠊乳膏组、RBBFGFG组这两组与模型组比较，瘢痕体积明显缩小，且据图2观察其质地变软，颜色变浅，有向空白组转化的趋势，证明紫蠊乳膏能有效改善瘢痕组织内纤维过度沉积的现象。

表5 给药21 d后兔耳增生性瘢痕厚度

表6 兔耳创面瘢痕面积

A：空白组；B：模型组；C：紫蠊乳膏组；D：RBBFGFG组

3.6 兔耳瘢痕病理切片

3.6.1 标本 将需检测兔耳组织共4例，用10%中性甲醛固定，固定状态良好。于2021-04-15送到成都里来生物科技有限公司进行检测，于2021-04-26得到检测结果。

3.6.2 方法 固定组织经全自动脱水机脱水[9]，包埋，切片后如图3所示。

图3 兔耳瘢痕HE切片检测流程图

3.6.3 图像采集 采用3DHISTECH(Hungary)生产的Pannoramic 250数字切片扫描仪对HE切片进行图像采集[10]，每张切片先于40倍下观察大体病变，而后选择要观察的具体区域，分别采集100倍和400倍的图片，观察具体的病变情况[11]，如图4所示。

图4 兔耳瘢痕HE切片检查图

3.6.4 结果 病理检查显示，空白组耳组织形态结构清晰完整，耳廓外覆有皮肤组织，内部由弹性软骨作为支撑；皮肤组织表皮较薄，表面被覆角质层，鳞状上皮层内细胞排列较为整齐，未见明显变性坏死；真皮内致密胶原交错排列，红染，胶原内可见血管、皮脂腺和毛囊等皮肤附属器，未见明显变性坏死；皮下可见疏松结缔组织、脂肪组织和肌肉组织、血管和神经等；未见明显病理变化。模型组耳表面皮肤组织受损，表皮内鳞状上皮细胞变性坏死，见细胞胞核固缩，胞质溶解，真皮内胶原排列紊乱，少量胶原溶解坏死，坏死区域内可见皮脂腺、毛囊等皮肤附属器基本不见；表皮、真皮及皮下可见大量嗜酸性细胞及少量淋巴细胞聚集；未见其他明显病理变化。RBBFGFG组耳表面皮肤组织受损，表皮及真皮溶解坏死，部分区域表皮坏死后缺失，表面可见痂皮形成，内含大量坏死细胞碎皮、白细胞及粉染浆液；真皮及皮下大量胶原纤维溶解坏死，形态结构模糊，坏死区域内可见嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润；未见其他明显病理变化。紫蠊乳膏组耳组织形态结构清晰完整，耳廓外覆有皮肤组织，表皮较薄，表面被覆角质层，鳞状上皮层内细胞排列较为整齐，真皮内致密胶原交错排列，红染，胶原内可见血管、皮脂腺和毛囊等皮肤附属器，未见明显变性坏死；皮下可见疏松结缔组织、脂肪组织和肌肉组织、血管和神经等；未见明显病理变化。

4 讨论

增生性瘢痕(HS)多发生于皮肤创伤的愈合过程[12]。迄今为止，尚无理想药物治疗。我国传统中药在治疗瘢痕方面有着悠久历史，如积雪草苷、苦参碱、丹参酮ⅡA、血竭素 B、地龙等均在治疗瘢痕方面取得良好效果[13]。紫草和美洲大蠊是我国常见的一种中药，紫草素是紫草中提取的主要活性成分，西医学研究[14]发现：紫草素可以抗菌消炎，缓解创面造成的不适感，促进伤口快速愈合等作用。美洲大蠊始载于《神农本草经》，有活血化瘀、解毒消积、生肌之功效，多用于癥瘕积聚、疮痈肿毒，外用可消肿生肌[15]。另外，美洲大蠊治疗增生性瘢痕具有中医理论依据及临床应用支撑。因此紫蠊乳膏在抑制增生性瘢痕中具有潜在的应用前景，有望成为治疗HS的药物之一。

由处方的优化和实验结果可知，紫蠊乳膏最佳处方为紫草提取物2.5 mL；美洲大蠊提取物2.5 mL；硬脂酸3.0 g；三乙醇胺3.0 mL；羊毛脂0.5 g；液体石蜡3.0 mL；蒸馏水9.0 mL；吐温-80 1.0 mL；尼泊金乙酯0.5 g。在本实验中，成功建立了兔耳瘢痕模型，每组获得6个瘢痕创面，具有统计学意义。实验结果表明: 紫蠊乳膏对兔耳瘢痕有明显抑制作用，在药物治疗组中瘢痕体积均减小，差异有显著性意义(P< 0.05)，且质地变软，颜色变浅，具有向正常皮肤(空白组)转化的趋势。药物治疗后HE切片显示，与空白相比，模型动物耳表面皮肤组织坏死及炎细胞浸润较为明显，病变程度较重[16]；与模型组相比，RBBFGFG组未见明显减轻，紫乳膏组耳表面皮肤组织结构较为完整清晰，未见明显病理变化。所以紫蠊乳膏抑制增生性瘢痕有一定疗效。

本研究建立了紫蠊乳膏的最优处方，并通过药理实验为祛瘢痕药物的进一步研发提供参考。