外周血T 细胞亚群和ST2L 在NSCLC 抗PD-1 治疗中的变化

许 姣，汤建磊，李小虹（通信作者）

（1 江苏大学附属武进医院<徐州医科大学武进临床学院>呼吸与危重症医学科 江苏 常州 213000）

（2 江苏大学附属武进医院<徐州医科大学武进临床学院>重症监护室 江苏 常州 213000）

（3 江苏大学附属武进医院<徐州医科大学武进临床学院>医学检验科 江苏 常州 213000）

肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤，2 0 1 8 GLOBOCAN 的数据显示，全球新发肺癌患者约209 万例，死亡176 万例[1]，我国肺癌发病率每年增长26.9%，2015年新诊断肺癌73.3万例，61万人死于肺癌[2]。在肿瘤微环境中，细胞程序性死亡受体1（PD-1）及其配体PD-L1 结合开启肿瘤免疫抑制程序，是免疫调节的重要组成部分。T 细胞是抗肿瘤免疫应答中的核心执行者，肿瘤细胞的PD-L1 蛋白与T 细胞上的PD-1 受体结合可传导抑制信号，限制T 细胞的活化、增殖、细胞毒性及细胞因子的分泌，下调抗肿瘤免疫应答，开启免疫逃逸。以纳武利尤单抗、帕博利珠单抗等为代表的PD1 抑制剂成为非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗新选择[3-4]。因此，筛选免疫治疗的最有效预测因子的研究亟需进一步开展。ST2（生长刺激表达基因2 蛋白）位于2 号染色体，可编码ST2L、sST2、ST2V 和ST2LV 蛋白[5-6]。ST2L 主要表达于Th 细胞、Treg 细胞等参与细胞增殖，而sST2 可能起到负性作用[7]。本研究者前期研究已证实NSCLC 癌组织中ST2 基因和ST2 蛋白高表达，且在非小细胞肺癌中ST2 介导了Th1/Th2 细胞因子漂移[8]。但目前免疫治疗的疗效预测标记物尚未明确，肿瘤组织中PD-L1 表达水平、错配基因修复蛋白（MMR）和微卫星不稳定（MSI）、肿瘤组织的突变负荷（TMB）等都可成为免疫治疗疗效的预测指标，但其预测能力尚存争议[9-10]。本研究旨在探讨晚期非小细胞肺癌患者抗PD-1 治疗前后CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、ST2L 水平变化，现报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1 月—2022年1 月江苏大学附属武进医院行抗PD-1 治疗的晚期非小细胞肺癌患者30 例为肺癌组，选取同期30 名体检健康者作为对照组。肺癌组男2 2例，女8 例；≥8 0岁7 例，＜8 0岁2 3例；吸烟≥600 支/年者20 例，＜600 支/年者10 例。对照组中男2 2例，女8 例；≥8 0岁5 例，＜8 0岁2 5例；吸烟≥600 支/年者18 例，＜600 支/年者12 例。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究符合《赫尔辛基宣言》要求。

纳入标准：①肺癌组病理组织学明确诊断为非小细胞肺癌（NSCLC）；②EGFR、ALK 阴性NSCLC；③ECOG 评分0 ～2 分。排除标准：①既往合并严重肝肾功能损害；②患有自身免疫系统疾病。所有患者均接受至少2 周期抗PD-1 治疗，并签署知情同意书。

1.2 方法

（1）TIMER（Tumor Immune Estimation Resource）数据库。TIMER 数据库（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析提示在NSCLC 中ST2 与CD4+T 细胞、CD8+T 细胞的相关性，通过ssGSEA 方法，得到每个样品中免疫相关基因集打分（免疫基因集包括免疫细胞类型、功能和通路）。通过聚类分析，将样品分为两组，即高免疫组（Immunity_H）、低免疫组（Immunity_L），然后分析每个免疫组ST2 的表达水平，发现ST2 可能和免疫治疗疗效密切相关。具体步骤：①通过TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载和整理数据；②ssGSEA 分析，得到每个样品免疫打分；③根据ssGSEA 打分，对样品分组，得到2 个免疫分组（Immunity_H、Immunity_L）；④免疫分组和ST2 的相关性。（2）治疗方法。肺癌组患者均接受PD-1单抗治疗，用药方法：信迪利单抗200 mg/次静滴，21 d为1 个周期或替雷利珠单抗200 mg/次静滴，21 d 为1 个周期或卡瑞利珠单抗200 mg/次静滴，14 d 为1 个周期。

1.3 观察指标

检测外周血CD4+、CD8+、ST2L 对照组、肺癌组患者在第1 次抗PD-1 治疗前及抗PD-1 治疗2，4周期后，空腹抽取外周血5 m L，EDTA 抗凝管，严禁冷藏用，SemiBio 细胞免疫芯片检测CD4+、CD8+；离心取细胞，BSP005 提取膜蛋白，冻存于-20 ℃。按照ELISA 操作步骤，检测ST2L。

1.4 统计学方法

使用SPSS 22.0 统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料采用（± s）表示，多组间比较行t检验；若不符合正态分布，采用中位数和四分位数［M（Q1，Q3）］表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H 检验；计数资料用频数（n）和百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1 TIMER 数据库分析ST2 与CD4+T 细胞、CD8+T 细胞浸润相关

TIMER 数据库显示ST2 和CD4+T 细胞、CD8+T 细胞浸润呈正相关（P＜0.05），见图1。

图1 ST2 和CD4+T 细胞、CD8+T 细胞浸润相关性分析

2.2 通过ssGSEA（single sample GSEA）发现ST2可能和免疫治疗疗效相关

通过ssGSEA（single sample GSEA）方法，发现ST2可能和免疫治疗疗效密切相关（P＜0.05，0.001，0.01，0.05“***”，“**”，“*”），见图2。

图2 ST2 与免疫治疗疗效相关性分析

2.3 各组外周血T 淋巴细胞亚群比较

肺癌组抗PD-1 治疗前后外周血CD4+细胞水平、CD4+/CD8+均低于对照组，而CD8+细胞水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；抗PD-1 治疗后外周血CD4+细胞水平、CD4+/CD8+较治疗前有升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗前后，CD8+细胞水平变化，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组外周血T 淋巴细胞亚群比较（ ± s，个/微升）

表1 各组外周血T 淋巴细胞亚群比较（ ± s，个/微升）

注：肺癌组抗PD1 治疗前后两组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与对照组比较，aP ＜0.05；肺癌组抗PD1 治疗后CD4+、CD4+/CD8+与抗PD1 治疗前比较，bP ＜0.05。

组别 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+肺癌组治疗前 400.63±48.14a 808.33±200.8a 0.52±0.13a肺癌组治疗后 539.93±169.09ab 720.67±131.17a 0.80±0.40ab对照组 998.33±428.85 612.67±247.93 1.61±0.47

2.4 各组外周血ST2L 的表达

与对照组相比，抗PD-1 治疗前后NSCLC 外周血低表达ST2L，差异有统计学意义（P＜0.05），且抗PD-1治疗后NSCLC 外周血ST2L 表达量较治疗前有明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 各组外周血ST2L 的表达

3.讨论

有效的免疫反应需要肿瘤细胞和T 细胞的刺激信号和免疫抑制相互作用维持T 细胞激活状态启动杀肿瘤细胞过程[11]。重塑并激活肿瘤微环境中的免疫作用，逆转T 细胞耗竭，增强免疫细胞杀死肿瘤细胞的能力是目前PD-1/PD-L1 抑制剂抗肿瘤的作用基础。本实验研究表明NSCLC 外周血CD4+细胞水平、CD4+/CD8+均显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示NSCLC 患者存在免疫功能抑制。抗PD-1 治疗后NSCLC 外周血CD4+细胞水平、CD4+/CD8+较抗PD-1 治疗前有显著增加，提示抗PD-1 治疗后NSCLC 免疫抑制有所改善（如表1）。本研究通过生物信息学方法分析，发现ST2 与CD4+T 细胞、CD8+T 细胞浸润相关。与健康人群比较，NSCLC 外周血低表达ST2L，抗PD-1 治疗后外周血ST2L 表达量明显增多，提示ST2L 的表达与PD1 治疗相关，进一步证实了ssGSEA（single sample GSEA）方法发现的ST2 可能和免疫治疗疗效相关。

NSCLC 外周血低表达ST2L 与前期实验结果不一致，分析可能原因为：①前期实验检测的为ST2 基因，本实验仅检测了T 细胞表面的ST2L，推测NSCLC 患者免疫功能低下且大部分T 细胞被募集至肺癌病灶中发挥抗肿瘤作用，需要进一步实验验证。②本样本量较小，需要扩大样本进一步验证。抗PD-1 治疗后NSCLC 外周血ST2L较治疗前增多，结合抗PD-1 治疗后NSCLC 外周血CD4+细胞水平升高，推测表达于Th 细胞表面的ST2L 可能作为非小细胞肺癌免疫疗效预测标志物，需要进一步展开研究。