杨木心材白腐菌预处理及生物化机浆制浆性能研究

罗文琪, 谢益民,2*, 张功侠

(1.湖北工业大学 制浆造纸研究院,湖北 武汉 430068； 2.湖北工业大学绿色轻工材料湖北省重点实验室,湖北 武汉 430068)

随着我国造纸行业对纸浆需求的持续急速增长,以环境友好和节能的方式充分利用木材和其它纤维原料显得日益迫切。近年来杨木碱性过氧化氢机械浆(APMP)制浆工艺在国内外得到迅速发展[1-3]。杨木具有生长迅速、纤维素含量高、木片白度高且易被浸渍软化等优点,因此，越来越多的造纸企业选择杨木作为生产原料,许多企业甚至使用来自人造板行业的杨木心材。杨木化学机械浆(CMP)得率较高,达80%～85%,但杨木高得率浆在磨浆过程中能耗高,另外,较低的物理强度在一定程度上限制了它的应用。利用生物制浆技术可以降低吨浆电耗和化学药品的消耗,减少环境污染,从而促进制浆造纸工业的可持续发展[4-6]。在制浆造纸过程中,使用生物法对原料预处理,在蒸煮和磨浆环节都可以达到节约能源的效果[7],并且可使纸张性能提高[8-10],降低造纸废水的污染负荷,提高废水的可生化性[11-12]。属于担子菌纲的白腐真菌是最有效和最广泛的木质素降解菌种,白腐菌具备繁殖速度快、分解木质素能力强等特点[13-15],它们通过分泌漆酶(Lac)、木质素过氧化物酶(Li-P)、锰过氧化物酶(Mn-P)对植物体细胞壁中的木质素进行降解,保留造纸工业所需要的纤维素和半纤维素组分[15]。其中,漆酶具有独特的优势,它作为一种胞外酶,不需要依赖其他酶系或H2O2的辅助就可完成对底物的催化,并且能够产生氧化能力极强的·OH,抑制其他微生物生长,这使得白腐菌有更广的适用性,能够降解大量结构不同的化学物质[16]。目前,已有研究者利用白腐菌预处理进行杨木机械法制浆,这种生物机械法制浆可以提高纸浆质量和降低能耗[17-18]。作为人造板工业剩余物的杨木心材虽然在CMP行业被广泛利用,但是由于杨木心材中木质素和抽出物含量高,导致耗碱量大。另外,杨木心材由于长期存在于酸性环境中,纤维强度低、纤维长度小,使得CMP的成浆质量较差。部分企业的生产实践表明：增加杨木心材的堆放时间来促进其自然发酵可以显著降低用碱量并提高纸张质量。研究者对杨木边材的CMP及生物化机浆(Bio-CMP)的研究比较多,但是对于白腐菌较难处理的杨木心材的Bio-CMP的制浆化学及成纸性能还未深入探讨。利用磨木木质素(MWL)可以研究天然木质素的结构,有助于了解白腐菌降解杨木心材木质素结构的机理。本研究采用白腐菌Trametessp.48424对杨木心材进行了预处理,分析白腐菌在木片上生长时产漆酶的能力,并深入探讨生物预处理过程中化学组分、纤维形态以及木质素结构的变化，并制备杨木Bio-CMP化机浆,以阐明白腐菌预处理对杨木CMP性能以及成纸强度的影响。

1 原料与方法

1.1 原料、菌种及仪器

1.1.1原料及试剂 杨木木片(心材和边材)由湖北华海纤维科技股份有限公司提供。杨木木片自然风干后存贮,水分约7%。实验所用试剂均为市售分析纯。

液体培养基(自制)：马铃薯提取液1.0 L,葡萄糖20.0 g,磷酸二氢钾3.0 g,七水硫酸镁1.5 g,维生素B1为8 mg,酒石酸氨0.94 g。马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：在液体培养基中加入20 g琼脂,制成PDA培养基。

1.1.2菌种及培养方法 白腐菌菌株Trametessp.48424,由华中科技大学生命科学学院微生物研究所生化培养室赠予。白腐菌Trametessp.48424的培养参照吴香波[19]的方法，将白腐菌菌株在PDA培养基上采用连续划线法进行无菌斜面接种,接种完毕后在30 ℃的生化培养箱内培养7 d，培养结束后将菌种置于4 ℃冰箱内冷藏保存。

在研究生物预处理杨木木片时,用接种环将斜面上的菌种挑三环接种到液体培养基中,在转速为180 r/min的水浴振荡培养器上培养7 d左右,水浴温度为28 ℃,在培养过程中白腐菌会生长成菌丝球体,培养结束后将装有菌丝球的摇瓶置于4 ℃冰箱内保存备用。

1.1.3仪器 SU8010场发射扫描电镜(SEM),日本日立公司；DZF- 6020 型生化培养箱,上海跃进医疗器械；MO-1水冷式振动球磨,日本中央工业机械；6700型傅里叶红外光谱(FT-IR)仪,美国Thermo Fisher Nicolet公司；AVANCE III 500MHz超导核磁共振谱(NMR)仪,德国Bruker公司；KRK2500-II高浓盘磨机,日本KRK公司；PFI型磨浆机,咸阳泰思特试验设备有限公司；RK-3A凯塞抄片器,奥地利PTI-Flank公司；L&W纤维形态分析仪,瑞典L&W公司。

1.2 白腐菌生物预处理杨木

将1 kg绝干质量的杨木木片用热水浸泡12 h,取出后放入蒸煮锅中,在固液比1 ∶4(kg ∶L)、蒸煮时间30 min、蒸煮温度100 ℃条件下进行汽蒸,不加任何化学药品。汽蒸结束后将木片送至单螺杆挤碾机进行挤压,然后将挤压后的木片置于高压灭菌锅中,121 ℃灭菌1 h。待木片冷却后,将培养完毕的白腐菌菌丝球(绝干3 g)分散在木片上,混合均匀后,置于30 ℃的生化培养箱中进行培养,湿度保持在70%～80%。定期观察木片上菌丝的生长情况,并测定白腐菌在木片上生长时所分泌的漆酶酶活。白腐菌生物预处理25 d后结束培养,将木片上的白腐菌菌丝洗净,进行后续制浆实验。

1.3 杨木磨木木质素的提取

取经过白腐菌Trametessp.48424预处理前后的杨木片,用Wiley磨粉碎成0.25～0.425 mm的木粉,再用苯/醇混合液(体积比1 ∶2)抽提木粉6～8 h。木粉风干后进行热水抽提,经乙醇梯度脱水后,进行真空干燥。然后将杨木木粉放入水冷式振动球磨机中，球磨总时长72 h。球磨完毕,按照Björkman[20]的提取过程制备杨木磨木木质素(MWL)。取杨木粉5 g,加入200 mL二氧六环/水(体积比96 ∶4)抽提,抽提3次,离心分离,取上清液,蒸干,真空干燥得粗MWL,然后将其用醋酸-水(体积比9 ∶1)溶解,离心分离,取上清液,搅拌条件下加入其体积10倍的水,分离,溶液蒸干得到水溶性MWL。将沉淀真空干燥,溶解于二氯乙烷/乙醇(体积比2 ∶1),离心分离。取上清液,滴加到其体积10倍的无水乙醚中,离心分离,将沉淀用无水乙醚清洗3次,石油醚清洗1次,再真空干燥,得到MWL。

1.4 杨木生物化学机械法制浆

1.4.1预蒸煮 在蒸气温度130 ℃下蒸煮30 min,固液比1 ∶4(kg ∶L)。将1.2节预处理后的杨木木片,加入适量NaOH进行预蒸煮。

1.4.2制浆 采用KRK高浓盘磨机对木片进行磨浆,浆浓控制在20%左右,转速3 000 r/min,磨浆间隙0.2～1.0 mm。筛浆后用PFI磨浆机进行打浆,使打浆度保持在40～45°SR,然后将浆料浓缩备用。预蒸煮过程中采用了不同NaOH的用量(6%,8%和10%)的杨木生物化学机械浆(Bio-CMP),还制备了杨木化学机械浆(CMP)作对比样(碱处理过程相同,缺少白腐菌预处理)。杨木Bio-CMP的制备流程具体如下：

1.5 分析与测试

1.5.1粗酶液提取及漆酶的测定 在白腐菌预处理杨木木片的过程中,白腐菌会依附于木片生长,同时会分泌漆酶。为了测定白腐菌依附木片生长时所分泌的漆酶酶活,从生化培养箱中取适量预处理过的木片,测定其水分后用超纯净化水按1 ∶20(g ∶mL)稀释,并用超声波振动10 min,取出酶液,在8 000 r/min转速下离心10 min,得到的上清液为粗酶液。取2 mL含有0.5 mmol/L ABTS的HAc-NaAc缓冲液(pH值4.5),加入一定量稀释的粗酶液,在室温下测定反应体系在420 nm处的前3 min吸光度的变化[21]。

1.5.2SEM分析 取经过白腐菌Trametessp.48424处理前后的杨木样品,干燥后用刀片切出需要观察的平面,经过喷金处理后,在SEM下观察纤维原料形态的变化。

1.5.3杨木化学成分的测定 测定杨木木片的化学成分,按照GB/T 2677.10—1995、GB/T 2677.8—1994、GB/T 2677.4—1993、GB/T 2677.5—1993、GB/T 2677.6—1994,分别测定综纤维素、Klason木质素、热水抽出物、 1%氢氧化钠抽出物、苯醇抽出物以及丙酮抽出物的含量。

Y=(m0-m1)/m0×100%

R=[w0-w1(1-Y)]/w0×100%

式中：Y—木片质量损失率,%;m0—预处理前的木片质量,kg;m1—预处理后的木片质量,kg;R—综纤维素(或Klason木质素)降解率,%;w0—预处理前木片中综纤维素(或Klason木质素)的质量分数,%;w1—预处理后木片中综纤维素(或Klason木质素)的质量分数,%。

1.5.4杨木MWL的分析 取预处理前后的杨木MWL 1～1.5 mg,与300 mg溴化钾粉末混合研磨后,在压片机中制得透明样品试片,采用FT-IR仪扫描，扫描范围400～4 000 cm-1,数据间隔1.93 cm-1，扫描次数32次。

取预处理前后的杨木MWL 80 mg,分别溶解于DMSO-d6中,利用NMR仪对样品进行扫描,得到13C NMR 图。测试过程中驰豫时间为1.75 s,采样时间为0.95 s,样品扫描约7 000次。

1.5.5杨木Bio-CMP纤维形态的测定 使用L&W型纤维分析仪对每组磨浆后的样品进行纤维形态测定,分析不同制浆工艺条件下杨木纤维的纤维长度、细小纤维含量和扭结指数等变化。

1.5.6手抄片的抄造和检测 采用凯塞快速抄片器进行抄片,纸页的定量为100 g/m2。干燥后平衡水分,纸页的抗张强度、耐破指数、环压强度、耐折次数分别按照GB/T 12914—2008、GB/T 454—2002、GB/T 2679.8—2016、QBT 457—2002进行测定和计算。

2 结果与讨论

2.1 杨木的化学组成分析

对原料杨木进行了化学组分分析,结果如表1所示。杨木心材的Klason木质素含量明显高于边材。杨木心材与边材的有机溶剂抽出物含量差别较小,说明杨木心材中部分树脂的极性比较大,用中性的有机溶剂很难抽提出来。杨木心材的1% NaOH抽出物含量和热水抽出物含量远高于边材,说明该品种杨木心材中含有大量的极性比较强的抽出物,主要成分为心材长期处于酸性环境中半纤维素受降解后产生的大量脂肪酸[22]。

表1 杨木木材化学成分分析Table 1 Chemical composition analysis of poplar wood %

2.2 白腐菌预处理杨木心材的结果分析

2.2.1漆酶分泌 白腐菌经过振荡培养,在液体培养基中生长成淡黄色的菌丝球,将菌丝球和少量酶液分散到杨木心材木片上,对杨木进行预处理后,菌丝球变成了白色丝状真菌覆盖在木片上生长,其生长状态如图1所示,预处理时间与白腐菌产漆酶酶活的关系见图2。

图1 白腐菌Trametes sp.48424在杨木心材木片表面的固态发酵 图2 白腐菌预处理杨木心材的时间对其产漆酶酶活的影响Fig.1 Solid-state fermentation of white rot fungus Trametes sp. 48424 on the surface of poplar heartwood chips Fig.2 The effect of white rot fungus pretreatment time of poplar heartwood on its laccase activity

白腐菌在木片上生长时会分泌漆酶,随着培养天数的增加,酶活先增加后降低,培养13 d中,漆酶酶活在第8天时达到最大值,为1.3 IU/mL。杨木心材含有大量的脂肪酸,白腐菌依然能够依附于此产大量的菌丝,并在杨木心材上分泌酶活,说明白腐菌受杨木心材中的脂肪酸的影响比较小。当白腐菌所需要的营养物质被耗尽时,不利于菌丝生长的代谢产物逐步积累增加,酶活也随之降低。同时,当酶液中本身的葡萄糖消耗完毕后,菌丝体依赖木质素生长,这时木质素降解开始[23],白腐菌在木材降解的过程中生长比较缓慢。

2.2.2预处理对杨木心材表面的影响 白腐菌未处理和处理后的杨木心材木片表面和横截面的SEM观察结果见图3。白腐菌预处理木片时,其分泌的酶对木片进行降解,使其表面变成多孔,并出现凹槽,导致细胞壁变薄,表现出木片在受到白腐菌攻击时细胞壁的松弛。这是因为白腐菌在降解杨木心材时,菌丝主要在纹孔处集中生长,沿着细胞腔蔓延,它可以从细胞腔到复合胞间层,逐渐降解木质素及少量纤维素与半纤维素[24]。

处理前before pretreatment：a.表面surface(×1 000); b.截面cross section(×500)处理后after pretreatment：c.表面surface(×1 000); d.截面cross section(×500)图3 杨木心材在白腐菌预处理前后的扫描电镜观察Fig.3 SEM observation of poplar heartwood chip before and after white-rot fungus pretreatment

2.2.3预处理对杨木心材化学成分的影响 在白腐菌处理木片的0～25 d时间里木片的质量有明显的损失,经测定和计算,培养25 d后质量损失为11.33%。木片经过白腐菌预处理后,综纤维素和Klason木质素的含量显著降低,降解率分别为10.98%和14.21%,Klason木质素的降解速率比综纤维素的降解速率快,说明白腐菌对木质素的脱除具有一定的选择性。

2.3 白腐菌预处理对杨木心材MWL的影响

2.3.1FT-IR分析 2 960～2 870 cm-1是甲基、亚甲基、次甲基的C—H伸缩振动吸收峰,以此峰为标准,观察各峰的变化(图4)。经过白腐菌预处理后,杨木心材MWL 3 500～3 300 cm-1处的吸收峰减弱,代表羟基减少,说明酚型木质素结构被降解的比例较高。1 662 cm-1是共轭羰基的吸收峰,该峰减弱说明经过白腐菌的预处理,杨木MWL侧链上的部分羰基被降解。1 600和1 510 cm-1是芳香环的骨架振动吸收峰,该峰变化不大,说明白腐菌处理对芳香环的影响比较小。

1.预处理前before pretreatment； 2.预处理后after pretreatment图4 白腐菌预处理前后杨木心材的MWL的FT-IR光谱(a)和13C NMR波谱(b)Fig.4 FT-IR(a) and 13C NMR spectra(b) of poplar heartwood MWL before and after pretreatment by white rot fungus

2.3.213C NMR分析 对比白腐菌预处理前后杨木心材的MWL的13C NMR波谱(图4(b)),在低场区域,δ162.5～172.0基本上来自羧酸的羰基[25],数量比较多,与原料组成分析的结果一致。经白腐菌处理后,这些羧酸基本上没有得到降解。在脂肪族区域,可以观察到与木质素β-O- 4结构相关的峰均有显著的减弱：δ72.7归属于β-O- 4结构的侧链Cα,δ60.6归属于β-O- 4结构的侧链Cγ[25],说明白腐菌降解木质素的反应主要发生在苯环侧链,尤其对β-O- 4结构的降解比较明显。在δ100～160的芳香环区域,总体上没有明显的变化,说明处理过程中苯环是比较稳定的。

2.4 白腐菌预处理对浆料纤维形态的影响

白腐菌未处理和处理后的CMP的纤维质量分析结果见表2。与未预处理CMP纤维相比,Bio-CMP的纤维长度略有增加,细小纤维含量显著减少,纤维扭结度增加。由于白腐菌预处理使木片软化、松弛,纸浆的长度和柔韧性得到改善,后续CMP制浆的过程中,可以使纤维分离变容易,减少磨浆过程中盘磨对纤维的切断,使得细小纤维含量减少,同时纤维长度增加,有利于提高成纸的物理性能。

表2 杨木心材CMP和Bio-CMP的纤维特性Table 2 Fiber characteristics of poplar heartwood CMP and Bio-CMP

2.5 白腐菌预处理对成纸物理性能的影响

白腐菌预处理对成纸物理性能的影响见表3。与CMP相比,Bio-CMP的物理性能得到显著改善。在相同的打浆度条件下,紧度、抗张指数、环压指数、耐破指数和耐折次数均得到显著提升。由于白腐真菌优先降解木材细胞壁中的木质素,使制浆原料更加多孔[26],从而促进化学蒸煮液更容易渗透,NaOH在木材纤维中能更好地扩散,磨浆效果得到改善。此外,白腐菌预处理使杨木心材细胞壁软化,局部细胞壁变薄,增加纤维柔韧性和溶胀性,从而增加了纸张内纤维间的结合,使紧度提高,并增加了纸张强度特性。尤其是NaOH用量为8%时，Bio-CMP的抗张指数为38.2 N·m/g，较CMP(32.9 N·m/g)提高了16.1%，耐破指数为2.04 kPa·m2/g较CMP(1.82 kPa·m2/g)提高了12.1%。

表3 杨木心材CMP和Bio-CMP的手抄片强度性能对比Table 3 Mechanical strength comparison of handsheet from poplar heartwood CMP and Bio-CMP

3 结 论

3.1利用白腐菌Trametessp.48424预处理杨木心材木片,并对预处理杨木木片进行生物化学机械法制浆,研究白腐菌预处理对杨木生物化学机械浆(Bio-CMP)性能的影响。结果显示：白腐菌能很好地在木片上进行固态发酵,并在预处理第8天时分泌产的漆酶酶活达到最大值1.3 IU/mL。SEM结果显示：白腐菌使木片表面出现孔洞和凹槽,细胞壁变薄。这使得杨木木片在蒸煮时利于药液的渗透。化学组分分析结果表明：白腐菌对Klason木质素的降解速率高于对综纤维素的降解速率。

3.2杨木心材木片经过白腐菌Trametessp.48424预处理后,其磨木木质素(MWL)的FT-IR和13C NMR谱图显示：白腐菌对木质素结构具有降解作用,尤其对β-O- 4结构的侧链(δ60.6和72.7)降解较为明显,而对木质素的芳香核影响比较小,说明白腐菌对木质素的降解主要发生在木质素侧链。

3.3杨木心材木片经过白腐菌Trametessp.48424预处理后,Bio-CMP纸浆的纤维长度略有增加,而细小纤维含量显著减少,纤维扭结指数增加。与未预处理的CMP相比,白腐菌预处理后的纸浆纤维更柔软,使纤维结合更紧密,成纸紧度和强度明显提高。