外周血循环微核糖核酸对射血分数保留性心力衰竭的价值

娄 婧 皇甫卫忠 李 蕊

1.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特 010059；2.内蒙古医科大学附属医院全科医学科，内蒙古呼和浩特 010010

2016年欧洲心脏病协会心力衰竭指南指出，左室射血分数（ejection fraction，EF）≥50%且伴心脏舒张能力下降、心肌肥厚及间质纤维化的心力衰竭，称为左室射血分数保留性心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）[1]，占65岁以上心力衰竭患者的75%以上，常见于妇女、肥胖患者、老年人和患有糖尿病或原发性高血压的患者[2]。HFpEF发病机制较为复杂，最新观点认为[3]，诸如原发性高血压、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、贫血、慢性肾病等共病条件下引起全身性炎症、心肌细胞重构、心肌纤维化导致左心室充盈压力增加，最终致左室舒张功能障碍。现有血清标志物在鉴别容量负荷正常的HFpEF与射血分数降低性心力衰竭（heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF）存在偏差，微核糖核酸（miRNA）与HFpEF的各种病理生理过程相关，因此本文对近年的研究做一综述，分析miRNA临床价值。

1 miRNA调控特点及优势

目前诊断心力衰竭最可靠的生物标志物仍是脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）以及前体脑钠肽（N-terminal precursor brain natriuretic peptide，NT-proBNP），但对于容量负荷正常的HFpEF患者，其诊断准确性存在偏差，需要结合临床表现、心脏彩超、心肺运动试验以助诊。与细胞内miRNA不同，外周血循环miRNA作为一种新型血清学标志物，表现出显著的稳定性和对内源性核糖核酸酶（RNase）活性降解的抗性以及组织表达的特异性，在HFpEF共病分类管理中展现了BNP及NT-proBNP所不具有的优势[4]；研究[5]发现miRNA结合NT-proBNP可以提高非急性HFpEF患者诊断的准确性，具有较好的临床应用前景。miRNA是一类小型非编码单链核糖核酸，由RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ）转录加工修饰后由细胞核通过Exportin-5复合物运送至细胞质被RNaseⅢ酶Dicer切割形成成熟miRNA，通过与蛋白质编码基因的mRNA配对来指导其转录后抑制[6]。一项对心肌组织活检的转录组学研究[7]选取了16例射血分≥45%的患者分为射血分数保留组与对照组，分析基因差异，发现743个基因存在差异，对应的生物功能包括心肌收缩，氧化磷酸化，细胞重构和基质组织，此项试验直接证明了HFpEF基因存在差异并且这些差异与现有的HFpEF病理生理机制相关。上述大量研究已经证明miRNA在HFpEF病理生理过程中发挥作用，因此miRNA对于HFpEF的临床应用价值不可忽视。

2 miRNA与HFpEF相关的病理生理机制

HFpEF发生的中心环节是多种疾病引发全身慢性低级别炎症和血管内皮功能障碍，前者是包括代谢综合征在内的多种慢性疾病形成的病理特征，且伴随着大量细胞因子、白细胞、趋化因子的浸润，进而形成了一种促炎环境；这种促炎环境可以通过代谢综合征相关的氧化应激加重血管内皮功能障碍，上述病理生理过程累及心血管导致心肌灌注减少，心肌营养物质供应减少，最终引起心肌肥厚、重构、纤维化、能量代谢异常、肌节功能异常。综上，共病诱发了一系列连锁反应的结果是心室舒张功能受损，形成HFpEF[8]。

2.1 免疫调控与炎症

衰老和共病的共同影响，是心室舒张功能不全的第一步，HFpEF早期血浆中的炎症标志物升高明显，全身慢性低级别炎症与心脏炎症随后发生并释放细胞因子、内皮黏附分子共同促进血管内皮功能障碍和免疫细胞浸润，免疫细胞通过旁分泌与心肌细胞交流，从而改变细胞周围微环境进一步促进心肌纤维化及肥厚，这种微环境的状态主要取决于巨噬细胞的极化状态即促炎或是抗炎，miRNA通过靶向与微环境相关的转录因子、蛋白、特定细胞因子发挥促炎或抗炎作用，储以微等[9]以细菌脂多糖刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7建立炎症模型，发现巨噬细胞内96个miRNA表达上调，30个miRNA下调，证明巨噬细胞通过miRNA参与炎症应答过程；HFpEF可由原发性高血压导致的心脏重构引起，巨噬细胞的积累和炎症是原发性高血压诱导心脏重构发病机制的关键因素，C-X-C趋化因子受体4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）是巨噬细胞介导的免疫反应的关键调节因子，研究发现[10]，骨髓特异性CXCR4缺失可抑制HFpEF小鼠心脏巨噬细胞浸润和炎症反应，从而改善心脏纤维化，改善心脏舒张功能；因此，miRNA在调控免疫相关微环境和炎症活动中起着中心作用。

2.2 血管内皮功能紊乱

HFpEF微血管内皮功能紊乱已被广泛认可，氧化应激增加、一氧化氮（NO）生物利用度失衡可能是其主要机制[8]，其中冠状动脉微血管功能障碍（coronary microvascular dysfunction，MVD） 被认为是HFpEF发生发展的重要环节，线粒体酶SIRT3可以靶向内皮细胞糖酵解途径影响冠状动脉微血管内皮细胞能量代谢异常，促进心肌纤维化、缺氧进而导致左室舒张功能障碍[11]，内皮细胞通过调节血管舒缩张力保持血液流动性、影响血管通透性，在心血管稳态中发挥着重要作用；一项对HFpEF合并2型糖尿病的动物实验模型的研究发现：miRNA-30作为糖尿病临床前模型中冠状动脉微血管功能障碍的循环生物标志物，可以促进脂肪酸β-氧化以及血管内皮功能障碍[12]；miRNA-126与血管内皮的完整相关，对2型糖尿病患者使用miRNA-126抑制剂出现血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）水平升高、单核细胞招募现象[13]，提示通过恢复内皮细胞miRNA-126水平来治疗内皮功能紊乱是一种值得探索的方式；一项研究将与炎性相关的miRNA-138同微血管功能障碍联系起来，发现抑制miRNA-138可以降低内皮NO合酶活性和NO合成，引起血管内皮功能紊乱，因此miRNA-138对维持血管内皮功能稳态也具有一定潜力[14]。综上，在共病导致氧化应激与血管内皮炎症的背景下，多种miRNA共同参与维持血管内皮功能的稳态。

2.3 心肌能量代谢受损

正常人心肌处于长时间工作状态，因此需要高能量来维持其收缩功能及离子稳态；健康人心肌细胞代谢95%能量来源于线粒体代谢，底物包括大部分脂肪酸以及一部分葡萄糖、乳酸、酮体和氨基酸（主要是支链氨基酸），HFpEF患者由于氧气供给不足引起代谢方式发生改变：心肌葡萄糖氧化降低而糖酵解、脂肪酸氧化增加[15]；心脏中线粒体含量很高，可以产生大量三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）为心脏持续工作提供能量。定位于线粒体内的去乙酰化酶3，（sirtuin 3，SIRT3）是去乙酰化酶家族的重要成员，在线粒体生物学的多个方面发挥重要的调节作用，研究发现miRNA-214作为SIRT3上游抑制因子可以直接靶向SIRT3下调其表达，导致线粒体功能障碍和能量代谢异常，引起血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚发生[16]。线粒体的形态和功能完整性受到高度动态的融合和裂变过程的调控，其中线粒体融合蛋白-2（mitofusion-2，Mfn2）是这些事件中的关键基因，最近的一项研究首次证实了miRNA-20b和Mfn2之间的直接靶标关系以及在肥大心肌细胞中上调miRNA-20b会损害Mfn2介导的线粒体Ca2+再摄取能力，加重心肌肥厚[17]。总之，miRNA可以作用于线粒体相关基因或蛋白直接或者间接影响心脏能量代谢。

2.4 心肌细胞纤维化与舒张功能障碍

心肌细胞纤维化重要表现是胶原纤维增加与沉积，心脏胶原沉积可以从以下三个方面理解：单核细胞释放的转化生长因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）促使成纤维细胞向产生胶原的肌成纤维细胞转化。研究[18]证明miRNA-21与TGF-β相关：在衰竭心脏成纤维细胞中高表达的miRNA-21可以通过其靶蛋白Smad7正向调节TGF-β信号通路激活促进胶原沉积的基因转录；Kumarswamy等[19]的研究结果发现当TGF-β被上调时，miRNA-21可通过PTEN/AKT通路刺激上皮细胞向成纤维细胞转化；长期压力负荷过重诱导的内皮素1、血管紧张素Ⅱ、醛固酮具有促纤维化作用，Dong等[20]研究发现miRNA-21可通过上调抗凋亡基因Bcl-2的表达促进HFpEF的发生，从而抑制心肌纤维化的凋亡，上述研究同时证实了抑制体内miRNA-21可阻止压力过载诱导的心脏间质纤维化和心脏功能障碍的发展。NO生物利用度降低导致微血管炎症诱导的成纤维细胞增殖，引起心肌间质纤维化和左室舒张功能障碍，左心室的舒张依赖于横桥分离和肌浆网Ca2+再摄取，N0依赖的环-磷酸鸟苷（cGMP）可降低肌丝钙离子敏感性，促进横桥分离，影响心肌的主动松弛[21]。Ikeda等[22]发现miRNA-1可通过直接调节心肌细胞增强因子2和GATA结合蛋白4的表达抑制NO参与的相关钙调通路；在主动脉收缩小鼠模型中，给予特异性药物抑制miRNA-24可以保护肥厚心肌细胞中l型Ca2+通道雷诺定受体信号通路结构和功能的完整性，影响肌浆网Ca2+再摄取过程[23]。因此，miRNA可以通过不同方式参与HFpEF患者心肌纤维化与左室舒张功能障碍进程。

2.5 miRNA驱动性别差异介导的HFpFE相关病理生理机制

雌激素在HFpFE相关病理生理机制中发挥重要作用，许多miRNA靶向特定基因启动子的雌激素（estrogen，E2）反应元件，通过结合E2驱动miRNA的表达；其次在胚胎时期为了使X连锁基因的表达水平在两性之间达到平衡会随机使雌性哺乳动物的一条X染色体失活，导致X连锁相关的miRNA表达增强，上述机制可能在调控HFpEF相关病理生理机制具有一定潜能[24]；总之，与HFpEF共病相关的血管炎性状态可能诱导了性别差异相关的miRNA网络，这种网络整合了血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞中多组功能相关的基因调控，从而导致性别差异介导的HFpFE相关病理生理过程。

3 miRNA对HFpEF诊断、相关信号通路、治疗的价值

现有的临床参数并不足以评估具有不同合并疾病的HFpEF，需要新的生物标志物进行补充，miRNA参与多个HFpEF共病的调控过程，值得深入研究。Watson等[5]使用miRNA阵列实验预测三组患者队列miRNA表达差异，上述研究还 发现miRNA-30c，miRNA-146a、miRNA-321、miRNA-221、miRNA-328和miRNA-375可 以 作为区分HFpEF与HFrEF的潜在生物标志物。对HFpEF与miRNA相关通路的进一步分析发现共有30个可能存在显著失调的途径[25]，下面就研究较多的2个信号通路进行阐述，转化生长因子-β信号通路：miRNA通过典型或非典型TGF-β通路刺激心肌成纤维细胞增殖与不成比例胶原合成，使促纤维化miRNA与抗纤维化miRNA处于动态平衡[26]。Yue等[27]首次证明了miRNA-101a作为心肌成纤维细胞中TGF-β信号通路的内源性抑制剂可以反过来被TGF-β抑制，这种互相抑制共同指导心肌成纤维细胞的激活、增殖和胶原合成。体内使用miRNA-101a模拟物治疗可抑制大鼠主动脉弓缩窄术后早期出现的miRNA-101a表达下调，防止随后的心肌纤维化，并保护左室功能。雷帕霉素靶蛋白（rapamycin，m TOR）信号通路：m TOR信号通路负责调控从胚胎期心血管发育到后期心脏稳态的一系列生理和病理过程[28]，研究发现[29]细胞周期素依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）抑制剂p27是miRNA-221在心肌细胞中的直接靶点，miRNA-221过表达可以通过p27/CDK2/m TOR轴来调节心肌细胞的自噬和心脏重构，揭示了miRNA-221作用于m TOR信号通路促进心力衰竭的机制。由于目前仍缺乏直接的证据证明HFpEF患者m TOR信号通路与miRNA相关性，因此是否可以说miRNA与HFpEF患者m TOR信号通路相关有待进一步研究。对于HFpEF的治疗难点在于共病的存在、诊断标准的复杂性、繁多的病理生理机制，未来的治疗方案应尽可能针对患者个体；miRNA作用于mRNA影响基因表达，反寡义核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）可以干扰mRNA以及调节蛋白质表达的功能，研究发现[30]，开发单链ASOs可以直接结合靶miRNA抑制其功能，进而抑制靶基因的表达；已有研究证实[31]，使用miRNA相关抑制药物可降低患者低密度脂蛋白水平；目前基于miRNA水平的治疗方案是一个很有前途的治疗方向，有待进一步探索与发现。

4 结语

从HFpEF的概念、诊断、病理生理机制、治疗全面分析miRNA的价值有助于本文更加深入理解疾病本身，目前对于HFpEF的病因尚不明确，大规模的、多中心的临床试验尚在进行中；通过本文总结，笔者认为在理解病理生理机制的方面应着眼于与HFpEF发病和进展相关的合并疾病及其与miRNA相关通路的研究，解决这一问题可能有助于本文从根本上识别易感个体和易感表型预防HFpEF发生；另一方面，miRNA作为一种新生物标志物，可能有助于HFpEF早期诊断、分类管理、预后分析，因此应高度关注其价值。