芹菜素对糖尿病大鼠肾功能的保护作用及机制研究

奚 丹，苏 卿

（1.长春医学高等专科学校，吉林 长春 130000； 2.大连医科大学附属第二医院，辽宁 大连 116000）

国际糖尿病联盟2020 年的数据表明，全球共有4.63亿糖尿病患者，在成年人群中的发病率为9.3%，预计到2040 年发病人数将会突破6.42 亿［1］。糖尿病肾病为糖尿病最严重的并发症之一，是导致糖尿病患者残疾及死亡的首要原因，因而进行早期预防极为重要［2］。目前，临床上控制高血压和降低血糖是预防及治疗糖尿病肾病的主要手段，但存在用药局限及诸多不良反应，效果难以令人满意［3］。炎症反应和氧化应激在糖尿病肾病的发生及进展中发挥重要作用，抑制炎症反应及氧化应激是延缓该病进展的有效方法［4］。中药应用历史悠久，具有多靶点、多途径的优势，在降低肌酐值、尿蛋白量及改善肾功能等方面均具有较大的优势，日益受到研究者的关注［5］。

芹菜素为黄酮类化合物，主要以植物黄色素的形式广泛存在于多种蔬菜、中药材及水果中［6］，具有抗炎、抗氧化应激、抗动脉粥样硬化、调节免疫及抗肿瘤等多种药理作用［7］。有研究发现，芹菜素可显著降低高脂喂养联合链脲佐菌素（STZ）诱导的2 型糖尿病大鼠及四氧嘧啶联合STZ 诱导的1 型糖尿病大鼠的血糖水平［8-10］。然而，关于芹菜素对糖尿病大鼠肾功能的保护作用及其分子机制并未阐明。本研究通过高脂饲料联合STZ 法建立糖尿病大鼠模型，给予芹菜素干预，探讨其对肾功能的保护作用，并从炎症反应及氧化应激的角度阐述分子机制，为芹菜素应用于糖尿病早期肾损伤的防治提供依据。

1 材料

1.1 实验动物 雄性清洁级SD 大鼠，体质量（200±20）g，购自上海杰思捷实验动物公司，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2018-0004。

1.2 试剂与药物 芹菜素（湖南赛禾生物科技有限公司，纯度＞90%，批号180419），用0.5% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成混悬液。厄贝沙坦片（美国威斯敏斯特公司，规格75 mg／片，批号69367-119-01）；STZ（美国Sigma 公 司，批号046K1206）；血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）检测试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号20190320、20190325）；白细胞介素2（IL-2）、IL-6、C 反应蛋白（CRP）检测试剂盒（上海晶抗生物工程有限公司，批号18070601、18091101、18112501）；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（上海酶研生物科技有限公司，批号20190118、20190328、20181225）；核因子κB p65（NF-κB p65）、NFκB 抑制蛋白α（IκBα）、核因子E2 相关因子2（Nrf2）、血红素氧合酶1（HO-1）、甘油醛3 磷酸脱氢酶（GAPDH）抗 体（英 国 Abcam 公 司，批号 ab207297、ab109300、ab137550、ab189491、ab8245）。

1.3 仪器 BSA2235 型分析天平（德国Sartorius 公司）；KDC-160R 型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；卓越型血糖仪（瑞士罗氏公司）；Chemray 240型全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；LKB-1 型超薄切片机（德国Leica 公司）；YKT-2800 型显微镜（上海永科光学仪器公司）；Epoch 型酶标仪（美国BioTek 公司）；X6 型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；MiniTrans-blot 型电转印槽及165-8001 型垂直电泳槽（美国Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药 采用高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射STZ 方法建立糖尿病大鼠模型［11］。大鼠经高糖高脂饲料喂养4 周后剂量腹腔注射30 mg／kg STZ 溶液，3 d 后测定空腹血糖（FBG），FBG≥11.1 mmol／L 者视为造模成功，FBG＜11.1 mmol／L 者排除。将造模成功的大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组（15 mg／kg）及芹菜素低、高剂量组（50、100 mg／kg），每组10 只，另取10 只健康大鼠（标准饲料喂养）作为正常组，灌胃给予相应药物，每天1 次，给药4 周，其中模型组和正常组大鼠灌胃等体积0.5%CMC-Na 溶液。末次给药结束，称定各组大鼠体质量，并用代谢笼收集24 h 尿液；随后腹腔注射20%乌拉坦进行麻醉，腹主动脉取血，4 ℃、3 000 r／min 离心15 min，分离得血清，分装后备用；颈椎脱位法处死大鼠，分离肾脏组织，称定质量后备用。

2.2 FBG、24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及肾肥大指数检测采用血糖仪测各组大鼠FBG 水平；通过双缩脲法采用全自动生化分析仪检测24 h 尿蛋白量；通过酶法采用全自动生化分析仪检测Scr、BUN 水平；肾肥大指数＝双肾质量／体质量。

2.3 HE 染色观察肾组织病理改变 使用4% 多聚甲醛固定肾脏组织，梯度乙醇脱水，石蜡包埋后切片，经脱蜡、水洗及苏木精-伊红（HE）染色后，在光学显微镜下观察各组大鼠肾组织病理改变情况。

2.4 肾组织炎症反应和氧化应激指标检测 取各组大鼠部分肾脏组织，用含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液进行充分裂解，4 ℃、12 000 r／min 离心10 min，分离得上清液，分装后冻存备用。参照说明书中操作步骤，采用酶联免疫吸附（ELISA）法分别检测肾组织炎症反应指标IL-2、IL-6、CRP 水平，氧化应激指标SOD、CAT 活性及MDA 水平。

2.5 Western blot 法检测肾组织NF-κB p65、IκBα、Nrf2、HO-1 蛋白表达 取“2.4” 项下肾组织匀浆上清液，二喹啉甲酸法检测蛋白浓度，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭及一抗、二抗孵育后，采用化学发光法进行显色、曝光及显影。图片扫描后，用Image J 软件进行灰度值分析，以GAPDH 为内参，计算目的蛋白相对表达量。

2.6 统计学分析 通过SPSS 18.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 芹菜素对糖尿病大鼠体质量及FBG 水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠体质量降低（P＜0.01），FBG 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，芹菜素各剂量组大鼠体质量增加（P＜0.01），FBG 水平降低（P＜0.01），而阳性药厄贝沙坦组大鼠体质量、FBG 水平均无明显变化（P＞0.05），见表1。

表1 芹菜素对糖尿病大鼠体质量及FBG 水平的影响（±s， n＝10）

表1 芹菜素对糖尿病大鼠体质量及FBG 水平的影响（±s， n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.2 芹菜素对糖尿病大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及肾肥大指数的影响 与正常组比较，模型组大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及肾肥大指数均升高（P＜0.01）；与模型组比较，芹菜素各剂量组和厄贝沙坦组大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及肾肥大指数均降低（P＜0.05，P＜0.01），见表2。

表2 芹菜素对糖尿病大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及肾肥大指数的影响（±s， n＝10）

表2 芹菜素对糖尿病大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及肾肥大指数的影响（±s， n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织病理改变的影响 正常组大鼠肾组织未见系膜细胞增生，细胞排列紧密、胞浆丰富，肾小管间质区域结构清晰，肾小球体积正常；模型组大鼠肾组织系膜基质增多，肾小管可见炎性浸润、空泡及肿胀，肾小球体积增大；芹菜素各剂量组和厄贝沙坦组大鼠肾组织系膜基质稍有增多，肾小管炎性浸润、空泡及肿胀等病理改变程度均有不同程度的缓解，肾小球体积增大趋势也低于模型组，见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理改变情况（HE 染色，×200）

3.4 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织炎症反应的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾组织IL-2、IL-6 及CRP 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，芹菜素各剂量组和厄贝沙坦组大鼠肾组织IL-2、IL-6 及CRP 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），提示芹菜素具有抑制糖尿病大鼠肾组织炎症反应的作用，见表3。

表3 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织炎症反应的影响（±s， n＝10）

表3 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织炎症反应的影响（±s， n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织NF-κB p65、IκBα 蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾组织NF-κB p65蛋白表达升高（P＜0.01），而IκBα 蛋白表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，芹菜素各剂量组和厄贝沙坦组大鼠肾组织NF-κB p65 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），而IκBα 蛋白表达升高（P＜0.01），提示芹菜素抑制肾组织炎症反应与调控NF-κB 信号通路有关，见图2、表4。

图2 各组大鼠肾组织NF-κB p65、IκBα 蛋白条带图

表4 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织NF-κB p65、IκBα 蛋白表达的影响（±s， n＝10）

表4 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织NF-κB p65、IκBα 蛋白表达的影响（±s， n＝10）

注：与正常组比较，**P ＜0.01；与模型组比较，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织氧化应激的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾组织SOD、CAT 活性降低（P＜0.01），而MDA 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，芹菜素各剂量组和厄贝沙坦组大鼠肾组织SOD、CAT 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），而MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），提示芹菜素具有减轻糖尿病大鼠肾组织氧化应激的作用，见表5。

表5 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织SOD、CAT 活性及MDA 水平的影响（±s， n＝10）

表5 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织SOD、CAT 活性及MDA 水平的影响（±s， n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.7 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织Nrf2、HO-1 蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾组织Nrf2、HO-1 蛋白表达均降低（P＜0.01）；与模型组比较，芹菜素各剂量组和厄贝沙坦组大鼠肾组织Nrf2、HO-1 蛋白表达均升高（P＜0.01），提示芹菜素减轻肾组织氧化应激的作用与调控Nrf2／HO-1 信号通路有关，见图3、表6。

表6 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织Nrf2、HO-1 蛋白表达的影响（±s， n＝10）

表6 芹菜素对糖尿病大鼠肾组织Nrf2、HO-1 蛋白表达的影响（±s， n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

图3 各组大鼠肾组织Nrf2、HO-1 蛋白电泳图

4 讨论

糖尿病肾病发病机制复杂，长期的高糖环境可以激活肾脏组织中的炎症反应，一方面能刺激细胞外基质聚集，增厚基底膜并逐步出现肾小球硬化；另一方面也能对肾小球内皮细胞造成直接损害［12］。IL-2、IL-6 及CRP 均为常见的炎性细胞因子，参与了糖尿病肾病的病情进展并直接与蛋白尿水平呈正相关［13］。研究发现，芹菜素可以有效降低游离脂肪酸诱导的L02 细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-8 等炎性因子的表达，抑制炎症反应［14］。本研究同样发现，芹菜素能够降低糖尿病大鼠肾组织IL-2、IL-6、CRP 水平，具有抑制糖尿病大鼠肾组织炎症反应的作用。NF-κB信号通路在炎症反应中起关键作用，可以介导IL-2、IL-6、CRP 等多种炎症因子的转录和表达［15］。研究发现，给予动脉粥样硬化模型大鼠芹菜素治疗后，NF-κB p65 蛋白表达降低，表明芹菜素改善大鼠动脉粥样硬化的作用与调控NFκB 信号通路有关［16］。本研究同样发现，经芹菜素治疗后，糖尿病大鼠肾组织NF-κB p65 蛋白表达降低，而IκBα 蛋白表达增加，表明调控NF-κB 信号通路进而抑制炎症反应是芹菜素保护糖尿病大鼠肾功能作用的潜在机制。

肾脏是氧化应激最敏感的器官之一，氧化应激是糖尿病肾损伤发生的重要环节，也是糖尿病肾病的诱发因素［17］。长期的高血糖环境可导致抗氧化酶的糖基化，使SOD、CAT 等抗氧化酶活性降低，减弱抗氧化系统清除能力；同时，持续的高血糖也能诱导机体产生MDA 等过氧化物产物，损伤肾脏，并逐渐发展为糖尿病肾病［18］。本研究发现，芹菜素能够增加糖尿病大鼠肾组织SOD、CAT 活性，降低MDA 水平，具有减轻糖尿病大鼠肾组织氧化应激的作用。Nrf2 是具有调控抗氧化应激活性的转录因子，在正常生理状态下，胞质内的胞质接头蛋白Keap1 与Nrf2 形成复合物，使Nrf2 的活性被抑制；在氧化应激状态下，Keap1与Nrf2 复合物解离，Nrf2 游离后进入细胞核，与抗氧化反应元件（ARE）结合，激活抗氧化酶基因HO-1 的表达，进而增强细胞的抗氧化能力［19］。杨丽等［20］研究发现，芹菜素可以升高妊娠期糖尿病大鼠肝组织Nrf2、HO-1 蛋白表达。本研究结果同样证实，经芹菜素治疗后，糖尿病大鼠肾组织Nrf2、HO-1 蛋白表达升高，表明调控Nrf2／HO-1 信号通路进而减轻氧化应激水平是芹菜素保护糖尿病大鼠肾功能作用的又一个潜在机制。

综上所述，本研究发现芹菜素能够降低糖尿病大鼠FBG 水平、24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及肾肥大指数，且能有效缓解肾组织病理性改变，证实其具有保护糖尿病大鼠肾功能的作用；进一步机制研究表明，该作用与抑制炎症反应及氧化应激有关，但深入机制还有待于进一步的研究。