缺氧状态下AH患儿通过调节DC功能加重AR免疫反应及机制研究*

林超萍 雷旭艳 唐隽 仇颖妍 王凯

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是最常见的慢性上呼吸道过敏性疾病之一，由于机体接触变应原IgE 介导的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，我国患病率为8%～21.4%，该疾病的大流行给患者和社会带来了沉重的负担，并影响其生活质量[1]。腺样体为咽扁桃体，位于鼻咽顶后壁的淋巴组织，参与咽淋巴环，是呼吸道的一道重要的免疫防御门户，在婴幼儿早期参与机体的免疫调节反应，一般10 岁以后开始逐渐退化萎缩，而腺样体肥大（adenoid hypertrophy，AH）可堵塞鼻咽部，引起鼻窦炎、中耳炎、心肺功能改变等临床症状，甚至影响儿童的额面部骨骼发育、性格形成和智力发育等[2]。研究表明AR 是AH 的主要原因[2-3]，而缺氧状态下AH是否能够加重AR 免疫反应及机制尚不清楚。树突状细胞（dendritic cell，DC）是功能最强的抗原提呈细胞，在免疫应答中发挥着重要作用，可分为髓样DC 和浆细胞样DC 等不同特异性DC 亚群，参与维持气道炎症、调节T 细胞免疫应答和免疫耐受等作用，诱发气道变应性炎症反应和免疫反应，而白细胞介素-17 受体B（human interleukin-17 receptor B，IL-17RB）、白细胞介素-33（human interleukin-33，IL-33）及其受体（ST2）、胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的受体（TSLPR）的表达可反映DC 的功能[4-5]。目前已有研究表明低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）可激活DC 功能而加重AR 的Th2 介导的免疫反应，Th2 细胞分泌白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）和白细胞介素-17（IL-17）等细胞因子，促进嗜酸性粒细胞反应和IgE 分泌，并产生抗炎作用，可诱导免疫反应[6-7]。因此，本研究拟分析AH 患儿及AH 合并AR 患儿HIF-1α 表达、DC 功能（IL-17RB、ST2 和TSLPR）、Th2 相关因子（IL-4、IL-5和IL-17）表达，并探讨AH 合并AR 患儿HIF-1α与Th2 相关因子的相关性，为指导AR 的诊断及治疗提供重要的基础试验证据。

1 资料与方法

1.1 一 般资料 选择2018 年1 月-2020 年12 月佛山市第一人民医院鼻科诊治的100 例AH 患儿进行前瞻性研究。纳入标准：（1）AH 患儿符合睡眠时出现响亮的鼾声，伴有呼吸暂停、憋气等症状，经纤维鼻咽镜检测为AH，其中腺样体/鼻腔比值＞0.6；（2）AR 诊断符合2 项及以上临床症状：鼻塞、清水样涕、喷嚏、鼻痒症等，且每天累计1 h 以上或症状持续性，皮肤点刺试验阳性，血清IgE＞0.35 kU/L。排除标准：（1）鼻腔狭窄、鼻中隔偏曲、药物性鼻炎、感染性鼻炎；（2）患有免疫功能低下的疾病，如先天性免疫球蛋白缺陷等。根据是否伴有AR 将患儿分为AH 组40 例（单纯性AH 患儿），AH 合并AR 组60 例（AH 合并AR 患儿），同期选择对照组50 例（健康对照儿童）。所有AH 患儿均在全麻下进行腺样体切除术，留取鼻腔黏膜腺样体部分标本，抽取所有研究对象血液标本待用。对照组儿童在鼻内镜下检查时钳取少许鼻咽淋巴组织标本。本研究通过本院医学伦理委员会批准，所有研究对象家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 采用美国BD FACSAria Ⅲ流式细胞仪，全自动多功能酶标仪购自德国BMG 公司，HIF-1α 试剂盒购自美国R&D 公司（货号：RDC3272）；IL-4、IL-5 和IL-17 试剂盒购自美国R&D 公司，货号分别为D4050、D5000B 和D1700。IL-17RB、ST2 和TSLPR 抗体购自美国R&D 公司货号分别为AF1207、AF523 和FAB5461P。

1.2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）将鼻腔黏膜组织腺样体标本切碎，匀浆后，稀释离心取上清液，提取蛋白；血液标本离心后留取血清液待测量。采用ELISA 法检测三组腺样体组织匀浆后的上清标本和血清中HIF-1α 和Th2 相关因子（IL-4、IL-5 和IL-17）表达。

1.2.3 流式分析术 采用密度梯度离心法分离出外周血单核细胞（PBMCs），采用CD14 免疫磁珠筛选单核细胞，将其置于含有重组人单核细胞集落刺激因子和IL-4 的培养基中培养，取细胞置于悬液中，PE 标记的IL-17RB、APC 标记的ST2 和Alexa Fluor 700 标记TSLPR 抗体孵育30 min，PBS 漂洗后加入相应二抗孵育，加入流式悬液，于流式细胞仪检测髓系DC 中IL-17RB、ST2 和TSLPR 的表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，计数资料采用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用Bonferroni 法；采用Pearson 分析HIF-1α 与Th2 相关因子的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AH 合并AR 组、AH 组和对照组一般资料比 较 AH 合并AR 组男35 例，女25 例；年龄5～9 岁，平均（7.48±1.37）岁。AH 组男20 例，女20 例，年龄6～9 岁，平均（7.27±1.53）岁。对照组男27 例，女23 例；年龄6～11 岁，平均（7.87±2.72）岁。三组一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 三组HIF-1α 表达水平比较 AH 合并AR 组、AH 组血液和鼻黏膜中的HIF-1α 水平均高于对照组，且AH 合 并AR 组均高 于AH 组（P＜0.001），见表1。

表1 三组HIF-1α表达水平比较[pg/mL，（）]

表1 三组HIF-1α表达水平比较[pg/mL，（）]

*与对照组比较，P＜0.05；#与AH 组比较，P＜0.05。

2.3 三组IL-17RB、ST2 和TSLPR 比较 与对照组比较，AH 合并AR 组、AH 组DC 中IL-17RB、ST2和TSLPR 的表达均明显升高，且AH 合并AR 组均高于AH 组（P＜0.05），见表2。

表2 三组IL-17RB、ST2和TSLPR比较[%，（）]

表2 三组IL-17RB、ST2和TSLPR比较[%，（）]

*与对照组比较，P＜0.05；#与AH 组比较，P＜0.05。

2.4 三组Th2 相关因子比较 与对照组比较，AH 合并AR 组、AH 组血液和鼻黏膜Th2 相关因子（IL-4、IL-5 和IL-17）的表达均明显升高，与AH 组比较，AH 合并AR 组均较高（P＜0.001），见表3。

表3 三组Th2相关因子比较[pg/mL，（）]

表3 三组Th2相关因子比较[pg/mL，（）]

*与对照组比较，P＜0.05；#与AH 组比较，P＜0.05。

2.5 AH合并AR患儿HIF-1α 的表达水平与Th2 相关因子的相关性分析 血清和鼻黏膜的HIF-1α 与IL-4、IL-5 和IL-17 均呈正相关（P＜0.05），见表4。

表4 AH合并AR患儿HIF-1α的表达水平与Th2相关因子的相关性分析

3 讨论

AR 是特应性个体接触变应原后，由免疫球蛋白IgE 介导，多种免疫活性细胞参与的鼻黏膜非感染性慢性炎症性疾病。AH 可阻塞呼吸道，表现为口呼吸、流鼻涕、打鼾、睡眠呼吸暂停和低鼻音等症状，手术切除是治疗该病的重要方式。AH 和AR是儿童常见病和多发病，两者可能同时存在，并可能引起相似的临床症状[8-10]。研究表明AR 是AH增生的主要因素，而在缺氧状态下AH 能否加重AR 的免疫反应尚缺乏充足的证据。阐明AH 缺氧状态对DC 功能的影响及其在AR 发病中的变应性炎症机制的作用，研究针对靶向DC 亚群细胞的治疗新策略是具有重要意义的。

HIF-1α 是一种反映机体缺氧状态的敏感性因子，在缺氧状态下，HIF-1α 的表达升高[11-12]。另有研究探讨AR 患儿存在细胞凋亡，其机制与Ras激活MAPK-HIF-1α 通路有关，但目前尚无系统性研究探讨AH 合并AR 患儿的HIF-1α 与Th2 相关因子的相关性[13]。本研究发现，与对照组比较，AH 组和AH 合并AR 组的HIF-1α 水平均明显升高，且AH 合并AR 组升高更为明显，表明AH 为慢性状态，可持续较长时间，常伴有部分或完全的鼻功能损害，导致口腔呼吸绕过鼻咽部有限的空气通道，造成慢性间歇性缺氧，同时AH 伴随AR 患儿缺氧更为明显。

白细胞介素-25（IL-25）、IL-33 和TSLP 是Th2 免疫反应发展过程中上皮细胞和DC 之间联系的基础，通过激活DC 成熟分化，刺激Th2 细胞活化，从而增强Th2 免疫应答[5，14-15]。另外，既往研究提示AR 患者骨髓DC 表达较高水平的IL-17RB、ST2 和TSLPR，与其介导的嗜酸性粒细胞性炎症反应有关[4-5]，并与AR 疾病严重程度相关，与Th2 水平呈正相关[4]，但上述研究尚未分析AH 患儿的缺氧指标变化及其合并AR 患者DC 功能指标变化。本研究发现，与对照组比较，AH 患儿和AH 合并AR 患儿的IL-17RB、ST2 和TSLPR 水平明显升高，且AH 合并AR 患儿升高更为明显，表明AH 患儿或AH 合并AR 患儿触发IL-17RB、ST2 和TSLPR信号通路从而激活DC 的功能在免疫应答中发挥着重要的作用。

Th2 免疫反应在AH 合并AR 患儿中发挥着重要作用，其可能通过释放IL-4、IL-5 和IL-17 等细胞因子触发免疫反应[16-18]。本研究中，与对照组比较，AH 组和AH 合并AR 组的IL-4、IL-5 和IL-17水平明显升高，且AH 合并AR 组升高更为明显；相关性分析提示，AH 合并AR 患儿HIF-1α 水平与IL-4、IL-5 和IL-17 均呈正相关。基于上述研究结果，笔者推测AH 患儿导致慢性缺氧症状，其鼻黏膜组织中HIF-1α 升高，诱发AR 的Th2 介导的免疫反应，主要机制是变应原刺激上皮细胞激活DC，释放趋化因子，募集血管内单核细胞进入气道上皮，从而分化为炎症性DC，同时DC 可调节T细胞活化，向Th2 和Th17 分化，促进B 细胞分化及合成IgE，可产生Th2 细胞因子（IL-4、IL-5 和IL-17）和趋化因子，导致气道嗜酸性粒细胞、肥大细胞和Th2 细胞浸润。研究提示，AH 合并AR患儿的病理机制可能与优势组织嗜酸性粒细胞增多和Th2 介导的炎症反应有关，但尚未探讨其与DC 功能的相关性[19-20]，而本研究考虑其可能机制为DC 介导T 细胞活化，为该病的机制研究提供了更为全面的证据。本研究为单中心小样本量的研究，且本研究仅为AH 及AH 合并AR 患儿缺氧指标、免疫相关指标检测及相关性分析，尚未进行功能性试验验证其具体机制，今后需进一步多中心、扩大样本量的研究，且在相应的细胞模型进行功能性实验。

综上，AH 患儿和AH 合并AR 患儿，存在HIF-1α、IL-17RB、ST2、TSLPR、IL-4、IL-5 和IL-17 的升高，且AH 合并AR 患儿HIF-1α 水平与IL-4、IL-5 和IL-17 均呈正相关，提示AH 患儿存在缺氧状态，可能引起DC 功能激活，触发Th2介导的免疫反应。在临床上，对AH 患儿，应积极治疗腺样体的肥大和增生，改善其缺氧状态，从而减轻AR 的Th2 免疫应答反应，可达到改善AR 的过敏免疫反应。