缺氧诱导因子-1α在渗出性老年性黄斑变性中的研究进展*

梁慧颖，曹明芳

1 福建中医药大学 福建福州 350122

2 福建中医药大学附属人民医院 福建福州 350004

我国自2000年正式从成年型转向人口老龄化社会以来[1]，各种与老龄化相关的疾病随之而来，包含现阶段全球三大致盲疾病之一的老年性黄斑变性（agerelated macular degeneration，AMD）[2]。因 此，AMD已经成为导致我国中老年人视觉功能下降的最大障碍之一。渗出性老年性黄斑变性（exudative senile macular degeneration，ESMD）的患病人数仅占AMD患病人数总数的10%～15%[3]，但却是可以导致患者视力严重下降并最终完全丧失视力的一种亚型。脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）生长引起的眼底出血、渗出性病灶和黄斑水肿是渗出性老年性黄斑变性的特征性病理表现[4]，也是导致ESMD患者视力损害的主要原因。

相关临床研究证据及动物实验数据显示，ESMD患者Bruch膜发生变性导致代谢产物发生异常堆积，使得视网膜RPE层得不到脉络膜毛细血管的血液滋养，导致ESMD患者视网膜的血氧供应与其他年龄相仿者相比显著降低[5]。因此，视网膜组织处于缺氧状态。缺氧诱导因子-1α （ hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）作为在缺氧状态下活跃的介导缺氧相关反应的代表性转录激活因子，由其上游的VHL蛋白（von hippel-lindau protein，pVHL）/辅氨酰羟化酶（prolyl hydroxylases，PHDs）以及p42/p44 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K） /蛋白激酶 B（ protein kinase B，PKB/AKT） /哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）等信号通路诱导激活[6]，进而能够与HIF-1α下游众多的促进血管新生的生长因子的特异性缺氧反应元件区域结合，达到血管新生而恢复必需供氧量的目的，这可能是CNV形成的关键病因。CNV的形成是ESMD发生的重要标志。

缺氧诱导因子-1α的结构及生物学功能

1 缺氧诱导因子-1α的结构

缺氧诱导因子-1在90年代由Wang等从人肝癌细胞培养中发现，其本质是一种多功能的转录因子[7]。它由α亚基和β亚基构成，其中，HIF-1α主要负责调节HIF-1的活性及功能，HIF-1β则负责保持结构的稳定性。HIF-1α是迄今为止在哺乳动物中发现的唯一在缺氧环境中被激活并发挥作用的转录因子，它在缺氧条件下可以通过转录激活下游相关细胞因子维持机体稳定还可以通过自身的活化控制疾病的发生与发展[8]。

HIF-1与HIF-2和HIF-3组成一个家族，统称为HIFs。其中HIF-1α是最重要的调节氧分压的亚单位。HIF-1α属于bHLH/PAS蛋白家族，以具有DrosophilaPer 、Human ARNT及Drosophila Sim结构为特征，统称为PAS结构域，并可调节多种生理功能、生长发育，包括神经发育和缺氧[9]。HIF-1α的N端部分包含一个与特定DNA结合的bHLH核心结构，其下游部分Pro/Ser/Thr，即脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸，是形成二聚体的特定部分[10]。C端部分包含三个结构域：反式激活域-C（TAD-C）、反式激活域-N（TAD-N）和氧依赖降解域（ODD）[11]。TAD能使HIF-1α被激活，依赖氧的ODD区因含有丰富的Pro/Ser/Thr，故能通过泛素化通路使HIF-1α降解，从而失掉活性。HIF-1α的N端的结构域可帮助其维持稳定的二聚体形态，而与下游的缺氧反应元件HRE结合方可发挥其转录功能[12]。

2 缺氧诱导因子-1α的生物学功能

关于HIF-1α的生物学功能，主要通过氧浓度变化以及HIF-1α蛋白自身的羟基化、乙酰化、磷酸化的调控、辅助来实现。在常氧状态下，HIF-1α的半衰期在正常氧浓度下＜5 min，它在人或哺乳动物体内几乎无法检测到。机体处于非缺氧状态下时HIF-1α可经由泛素蛋白酶体的途径的泛素化作用，导致HIF-1α降解以达到阻止其转录激活的目的。这是由于C末端的ODD区含有两个辅氨酸残基：Pro402及Pro564可以促进HIF-1α与pVHL的结合，故细胞浆内的氧感受器——PHDs，可以使ODD区的脯氨酸残基可发挥其羟化作用以达到以上结合[13]。而缺氧状态下，HIF-1α的C末端的天冬氨酸残基可通过HIF-1α的抑制剂FIH-1使HIF-1α与CREB结合蛋白的结合被阻断，进而使得HIF-1α稳定表达并与HIF-1β结合，通过转位进入细胞核形成异源二聚体。最终功能可与HRE，即缺氧反应元件的基因序列结合。HRE由于其自身的结构特点上具有高度可变的测序基因，故可以使组织或细胞的缺氧及反应特异性增强[14]。由于HRE的高度可变性，使得HIF-1α能够调节的靶基因种类增多，包含血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）、血管生成素（angiopoietin，Ang）、胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）、基质细胞衍生因子-1（stromal cellderived factor-1，SDF-1）等。

HIF-1α在ESMD发病中所起的作用

无论是外界刺激抑或是机体自身病理过程导致的缺氧，均可引起HIF-1α的稳定表达。缺氧所诱导的上游信号通路通过调控HIF-1α蛋白活性，使机体对局部组织缺氧作出相应的代偿性反应，从而引起一系列HIF-1α下游与促进血管新生相关的因子表达水平升高，并将缺氧信号传入眼内细胞，促使CNV的形成，导致ESMD的发生。

1 HIF-1α的上游信号通路

MAPKs家族信号通路 MAPKs是广泛存在于真核生物体内的可以调控细胞缺氧、凋亡及增生等反应的一种激酶信号系统[15]。目前研究发现MAPKs家族信号通路至少包含3条信号通路，即p42/p44/MAPK、JNK/MAPK、p38/MAPK信号通路。MAPKs家族信号通路通过逐级磷酸化使细胞内信号不断放大而传导至下游的HIF-1α，从而达到调控下游HIF-1α的转录激活过程的目的。

p42/p44 MAPK作为双丝/苏氨酸蛋白激酶，对多种转录因子的磷酸化的起到高度调节作用。丝/苏氨酸蛋白激酶对HIF-1α的磷酸化具有重要的作用，由于p42P/44 MAPK是双丝/苏氨酸激酶，因此能够调节作为缺氧诱导转录激活的HIF-1α的活性，缺氧所导致的细胞膜内外电泳的平衡失调而引发p42/p44/MAPK信号通路激活对下游转录因子HIF-1α的激活起到重要作用。P42/p44MAPK通路对于HIF-1α激活的主要机制可能是直接磷酸化HIF-1a或上调其辅助因子p300来诱导HIF-1α的反式激活功能。HIF-1α的本质是一种高度磷酸化的蛋白，且HIF-1a会引起明显的电泳迁移。亦有动物实验证实P42/P44 MAPK能够使HIF-1a磷酸化，且能有效地启动HIF-1α的转录活性，但和HIF-1α的稳定性无关[16]。综上所述，缺氧可以导致 p42/p44 MAPK的活化，入核后促使缺HIF-1α的磷酸化，激活转录VEGF等与血管新生相关的下游因子，作用于内皮细胞，从而导致视网膜及脉络膜新生血管的形成。这一结果对于理解和未来防治眼内新生血管相关疾病具有一定的价值。

JNK最初被命名为应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK），是在小鼠肝脏中被发现的一种激，随着它对c-Jun转录因子起到磷酸化并能够使后者被激活的功能被发现，故更名为JNK[17]。JNK被一系列的磷酸化事件激活后在体内通过相关蛋白及因子的转录、修饰后参与由缺氧引起的由HIF-1α参与的相关基因转录。P38 MAPK是MAPK家族的另一种类型的SAPK，多种细胞外刺激均通过促进 P38 TGY主干磷酸化而触发P38信号途径，这些刺激多数与细胞应激反应有关[18]。P38激活在HIF-1α转录、血管生成及蛋白合成过程中起到重要作用。p38对HIF-1α调节作用主要体现在其能使HIF-1α实现磷酸化且能抑制HIF-1α的羧基抑制区的抑制作用。此外，JNK及p38对VEGF的基因稳定表达亦有重要作用，这主要通过阻断VEGF基因的降解来达到[19]。

Pl3K/Akt/mTOR信号通路在多种细胞中均有表达，参与调节细胞的新陈代谢、增殖、凋亡等生理过程。Pl3K是一种由催化亚基和调节亚基构成的异二聚体，可被多种生长因子和信号传导复合物激活。磷脂 酰 肌 醇3，4，5-三 磷 酸（phosphatidylinositol 3，4，5-P3，PIP3）是PI3K产生的重要脂质第二信使，在多条信号转导途径中起着至关重要的作用。Akt是Pl3K主要的下游信号分子，其氨基端的PH结构域能够识别PIP3并产生相互作用，引起Akt催化结构域及调节结构中的308位苏氨酸（Thr308）和473位的丝氨酸（Ser473）两个识别位点发生磷酸化，从而使Akt活化从胞浆移位到胞膜上并启动下游的信号分子，其中就包括激活mTOR，mTOR活化后可继续向下游传导信号，最终产生调节蛋白质合成、血管新生和细胞周期等生物学过程的效应[20]。有研究发现，PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活可通过HIF-1α依赖性和独立机制增加VEGF的分泌[21]。一方面，mTOR的主要复合体形式mTORC1能够通过直接增强VEGF及其下游相关因子的产生促进血管新生过程；另一方面，PI3K/AKT/mTOR信号通路还能增强HIF-1α的表达，而HIF-1α表达的增加则会进一步促进VEGF的表达，加速新生血管的形成。

2 HIF-1α调节的下游因子

视网膜的生理结构包括具有高代谢、高需氧特点的视网膜视锥细胞及视杆细胞，此外，色素上皮的氧气供应依赖脉络膜毛细血管层[22]。由此可见，缺氧、缺血对视功能的影响是显著的。视网膜新生血管及脉络膜新生血管尽管形成部位及病理机制不尽相同，但均是由于局部的缺血、缺氧导致。且众多学者认为，在ESMD的脉络膜新生血管形成过程中，缺氧状态下HIF-1α稳定表达所诱导的下游新生血管相关因子的表达起到重要作用[23]。

HIF-1α对VEGF的调控作用 CNV不同于眼底的正常血管，它由于血管壁发育不完善而容易导致眼底反复的出血、渗出直至产生瘢痕化组织，且这种病理形态波及黄斑区可引起中心视力的下降[24]。而在血管新生的生长过程中位于视网膜色素上皮巨噬细胞中的VEGF能通过激活内皮细胞的迁徙及有丝分裂以诱导新生血管形成。HIF-1α的调控下可以使VEGF过度表达，其发生机制在于缺氧状态下使得HIF-1α无法被ODD区的泛素化途径降解而得到稳定的表达，由此可以进入细胞核内并与VEGF结合促进其表达。因此，受HIF-1α转录调控的VEGF在脉络膜新生血管的产生、形成及ESMD的发病中起到的重要作用得到充分佐证。HIF-1α对EPO、Ang、PLGF、SDF-1的调控作用 除此之外，多种细胞因子的上调均与HIF-1α的转录作用有关，如：EPO、Ang、PLGF、SDF-1等。HIF-1α对新生血管的形成的调节，并不仅仅只是简单的促进介导血管新生的和核心因子VEGF的表达上调，而是通过在缺氧时实现HIF-1α对下游众多新生血管相关的细胞因子的调控方可充分发挥促血管生成的作用。

EPO是一种激素类糖蛋白，可以激活红细胞的生成，它是迄今为止被发现的第一个HIF-1α靶基 因[25]。关于EPO的研究，人们的对它的认识水平由最初的认为EPO仅是促进红系祖细胞成熟和增值的关键，而后进一步研究发现EPO可以通过促进血红蛋白合成而成为人体在经受缺氧时的重要代偿机制。在缺氧的条件下为提高机体运输氧气的能力，需要通过提高EPO的表达水平来促进红细胞的生成以达到纠正机体内缺氧情况。王济民[26]等通过观察碱烧伤造膜CNV大鼠的动物实验观察到随着缺氧程度增强，HIF-1α的表达亦增强，而EPO作为受到HIF-1α调控的下游靶基因之一，表达也随之上调，从而达到促进新生血管生成的目的。

Ang家族是由Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4组成的一族分泌型生长因子，由视网膜色素上皮细胞分泌。其中，Ang家族中Ang-1和Ang-2是与血管生成关系最密切的成员，因二者之间存在相互拮抗作用并共用同一个受体Tie-2，故二者存在竞争作用。据前人研究显示，Ang-1对新生血管的作用不体现在对内皮细胞的增殖作用，而是通过抑制内皮细胞的凋亡进而参与内皮细胞的迁移及促进新生血管的成 熟[27]。Ang-2则在血管形成早期与VEGF协同参与血管发芽及转化。另有基础研究证实受体Tie-2以及Ang-1和Ang-2存在于脉络膜新生血管组织中，此外，Ang-1和Ang-2的表达和分泌直接或间接的受HIF-1α的调控[28-29]。在HIF-1α的调控作用下Ang-2可以通过打破Ang-1诱导的血管稳定状态，从而使血管外周细胞与内皮细胞分离，从而更好的接受其他促血管生成因子的作用，在Ang家族与其他促血管生成因子的协调作用下，促发新生血管的形成与发展，这与CNV的形成亦密切相关。

PLGF是一种分泌型二聚体糖蛋白，于1991年从人体胎盘cDN文库分离纯化而来[30]。作为VEGF家族中的一员，PLGF的蛋白氨基酸排序与VEGF的同源性高达42%，其促进新生血管生成的作用亦不容忽视。缺氧条件下，HIF-1α对调节全是的稳定状态起着主导作用，可通过调控下游PLGF来刺激血管内皮细胞的增生及迁移，并能加强VEGF-A药物对新生血管的抑制作用的活性，与眼部的病理性新生血管密切相关。Ioanna Z等[31]通过使用酶联免疫吸附试验对ESMD患者及其他缺氧相关视网膜病变患者的血浆中PLGF浓度进行测定发现ESMD患者的血浆PLGF水平显著升高，这也证实了缺氧诱导发生的ESMD与PLGF的表达水平的相关性。

SDF-1是一种氨基酸多肽趋化因子，它由SDF-1α及SDF-1β两个亚基构成[32]。SDF-1的特异性受体为CXCR4，CXCR4受体可使SDF-1通过与相应的干细胞黏附或迁移至局部缺氧组织，介导新生血管生成以促进缺氧组织的修复。在缺氧环境中，造血干细胞可以分化为血管内皮祖细胞，然后依赖HIF-1α调控SDF-1等趋化因子使血管内皮细胞完成迁移，参与缺氧组织中新生血管形成。前人研究中的动物实验及细胞实验中观察到HIF-1α表达水平迅速升高，随后SDF-1在人视网膜色素上皮细胞中的表达水平亦升高，证实了缺氧特异性HIF-1α对人视网膜RPE细胞上SDF-1的表达存在调节作用[33-34]。因此，通过对SDF-1上游转录活性因子HIF-1α的抑制或对于两者的共同干预将对整个视网膜新生血管疾病的发展和并发症治疗具有广泛应用前景。

通过抑制HIF-1α表达治疗ESMD的研究

目前对于ESMD 的治疗中，抗VEGF药物已成为眼科临床医师公认的首选用药，目前已应用于临床的抗VEGF药物包括雷珠单抗、康柏西普、阿柏西普等。但抗VEGF药物在临床应用过程中亦显现出许多缺点，因此，以HIF-1α为治疗靶点的研究方向亦得到众多学者的关注。

1 中医药对于HIF-1α的研究进展

传统中医药治疗不仅价廉效彰，且能调和全身机能，在渗出性老年性黄斑变性的诊疗上亦有其优势，通过个体化“辨证施治”，以“整体观念”调整全身脏腑、气血、阴阳，改善整体、黄斑局部的缺血、缺氧状态，使“五脏六腑之精气上注于目”。因此，中医药在渗出性老年性黄斑变性的治疗中占据重要的地位，目前眼科研究学者们针对渗出性老年性黄斑变性的治疗主要从肝、肾论治。李传课教授等[35]认为，年老和肝肾不足是渗出性老年性黄斑变性的基本病理，并采用滋养肝肾治法，方用滋阴明目丸加减。曹明芳教授等[36]认为渗出性老年性黄斑变性的中医疗法应从肝、肾论治，肝肾同源、互为资本，目受精血充养故得“清、明”，方选归芍地黄汤加减。庄苹等[37]认为肝肾不足时本病最基本的病机，并采用四物五子汤以补益肝肾为主进行临床观察，证实了渗出性老年性黄斑变性患者血液流变学状况可以通过补益肝肾而得到改善。四物五子丸全方具有补益肝肾、益精养血的作用。现代药理研究对四物五子丸组成药物的研究表明，白芍[38]具有缓解痉挛及疼痛痛、抵抗惊厥、消炎、灭菌、调节免疫及血管扩张、抗血小板凝集等作用，其主要成分白芍总苷可通过抑制PI3K/HIF-1α信号通路发挥调控作用。当归[39]挥发油能够通过抑制PC1细胞因缺血和缺氧而诱发的自噬激活来保护受损细胞。此外，当归的另一种活性成分阿魏酸钠可以抑制HIF-1α的表达。熟地黄[40]具有抗衰老、通过改善血液流变学，防止各种诱导阻碍外周微循环的慢性疾病的作用。川芎[41]其有效成分川芎嗪可以通过下调HIF-1α的表达，维持促血管调节因子与抑制血管生成因子之间的动态平衡，保持血管正常化。菟丝子、覆盆子、枸杞等可以抗衰老、抗缺氧，枸杞子提取物能有效地保护视网膜。地肤子、车前子抗炎、抗氧化。因此，关于四物五子丸治疗渗出性老年性黄斑变性的机制在于可改善缺血缺氧状态、抑制氧化应激反应，抗炎，调节免疫等，抑制病理性新生血管生长，提高视力。若能使中药与现代医疗手段相结合，就HIF-1α在ESMD疾病发展中扮演的重要角色着手，或许能在ESMD的防治方面启迪新的思路。

2 抗HIF-1α药物的研究进展

抗HIF-1α药物的种类繁多，且其对CNV的抑制作用已得到证实。抗血小板凝集剂YC-1能抵抗细胞中HIF-1α与DNA的结合，此外，还可降低钴的表达来减少HIF-1α蛋白的累积[42]。从而下调HIF-1α所调控的下游因子EPO及VEGF的表达水平，以达到抑制CNV发生的作用。地高辛作为强心苷类药物，其对与新生血管的抑制作用来源于它对肿瘤的应用，而后有研究表明地高辛能抑制HIF-1α及VEGF的表达[43]。针对HIF-1α基因的抑制药物对治疗CNV亦显示出重要作用，如小干扰RNA则在小鼠动物实验中被证实可以减少HIF-1α及VEGF mRNA和蛋白的表达[44]。此外，抗HIF-1α药物在临床的应用广泛，包括在肿瘤、白血病及其他缺氧诱导的疾病中均能发挥作用。

小 结

目前针对ESMD的治疗，中医药虽然有效但存在疗程较长，且对于促进新生血管消退效果不佳[45]；现代医学用药中以抗VEGF药物为主流，对促进已有的新生血管消退有一定疗效，但存在着需要反复注射药物且不能抑制新的CNV生成[46]，因此，仅仅使用抗VEGF药物不足以解决所有问题。此外，使用VEGF抑制剂不仅会作用于结构脆弱且不健康的新生血管的VEGF，正常血管的VEGF也会受到影响。加之HIF-1α在ESMD发生、发展过程占据了关键地位，所以对于HIF-1α在ESMD治疗中的研究显得尤为重要。抑制HIF-1α不仅能阻断对血管生成占最主要地位的生长因子VEGF的传导，还能阻断HIF-1α下游所调控的EPO、Ang、PLGF、SDF-1等与血管新生密切血管的生长因子。目前，对于HIF-1α抑制剂在缺氧导致的视网膜脉络膜新生血管的应用已有研究成果，为ESMD的治疗提供了新的靶点。抗血小板凝集剂YC-1、地高辛、鱼藤素等作为HIF-1α抑制剂在激光诱导CNV的动物实验中显示出了对于HIF-1α蛋白活性及对包括VEGF在内的受HIF-1α调控的生长因子的抑制作用[47]。不同于抗VEGF药物的是HIF-1α抑制剂不仅可以抑制已有的新生血管的进展，还可以减少未发生的新生血管生成，此外，它对于视网膜的正常发育及其他正常微小结构并无破坏作用。故我们可以认为HIF-1α抑制剂对于ESMD的治疗存在很大的潜力，是值得深入探索的治疗靶点。