miR-186-3p通过靶向调控MCM2对宫颈癌发生的作用机制研究

杨晓飞 田静伟 刘京 于丽娜

2018年数据显示,宫颈癌在常见恶性肿瘤中位居第4位,其死亡率逐年增加[1],在超过50万名接受调查的宫颈癌患者中,死亡率高达60%[2]。随着健康教育、人乳头瘤病毒(human papilpapillomovirus, HPV)疫苗的接种以及宫颈癌筛查力度的加大,其发病率、死亡率得到有效遏制[3]。但是该病的发生机制复杂,目前仍然是研究的热点。microRNAs是非编码RNA,通过与靶标mRNA结合,调控转录后修饰靶基因的3′非翻译区[4]。miR-186参与多种癌症包括乳腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤以及黑色素瘤等的发生,可促进细胞凋亡并抑制细胞增殖和有氧糖酵解。有研究表明,miR-186-3p能促进乳腺癌细胞的凋亡,并抑制细胞的增殖和有氧糖酵解等[5]。研究发现miR-186-5p在HPV感染的宫颈癌细胞中表达下调,表明miR-186可抑制宫颈癌的上皮间质转化细胞,促进宫颈癌细胞凋亡[6]。微染色体维持复合物组分2(minichromosome maintenance complex component 2, MCM2)参与真核生物基因组复制的启动[7]。有研究表明,MCM2是诊断和预测宫颈癌发生的关键基因[8]。本研究旨在探讨miR-186-3p与MCM2在宫颈癌中的作用,为宫颈癌的治疗提供新的见解。

材料与方法

一、一般资料

选取2019年9月至2021年3月在石家庄市妇幼保健院确诊为宫颈癌的患者60例,年龄35～65岁,平均(44.35±12.01)岁。收集患者宫颈癌组织及相应正常组织(距肿瘤组织约3～5 cm),并储存于液氮(-196 ℃)中。排除患有其他类型的疾病,如肝肾功能不全、自身免疫系统疾病、严重精神障碍的患者,以及已接受化疗、放疗或其他治疗的患者。本研究经石家庄市妇幼保健院伦理委员会批准,所有患者及其家属均签署同意书。

二、主要材料

HeLa(宫颈癌细胞)和HcerEpic(人正常宫颈上皮细胞)细胞均购自中国科学院上海细胞库。Lipofectamine®2000转染试剂和RT-qPCR试剂盒均购自赛默飞世尔科技(中国有限公司);引物由上海生工生物有限公司完成。TRIzol试剂购自深圳欣生源生物科技有限公司,PrimeScript RT-PCR试剂盒购自北京智杰方远科技有限公司。MCM2抗体购自Abcam,BCA检测试剂盒购自中国南京凯根生物技术有限公司。

三、方法

1.细胞转染与培养:将Hela及HcerEpic细胞培养于10%血清蛋白的DMEM培养液中,置于95%CO2、37 ℃培养箱内。按照Lipofectamine®2000转染试剂盒说明书严格进行转染实验,当细胞融合至80%时,胰酶消化,将细胞接种于培养皿内。

2.RT-qPCR检测miR-186-3p和MCM2的表达情况:首先用TRIzol试剂提取总RNA。使用PrimeScript RT-PCR试剂盒合成cDNA。PCR反应条件:42 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,40 个 95 ℃循环5 s和60 ℃ 30 s,共40个循环。采用U6作为内参标准化miRNA的表达,其他基因的表达以GAPDH为内参。采用2-△△Ct方法计算相对表达量。miR-186-3p上游引物序列:5′-GCCCAAAGGTGAA-TTT-TTTGGG-3′,下游引物序列:5′-CAGTG-CGTGTCGTGGAGT-3′;MCM2上游引物序列:5′-AGCACTTGATGAACTCGGGG-3′,下游引物序列:5′-AAGCCAACAGATACCAGCGT-3′;U6上游引物序列:5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,下游引物序列:5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;GAPDH上游引物序列:5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′;下游引物序列:5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTG-3′。

3.RT-qPCR检测siMCM2的表达情况:将MCM2的小干扰RNA(siMCM2:5′-CAGGTGACAG-ACTTTATCAAA-3′)和阴性对照(siNC:5′-CAGGTGACAGACTTTATCAAA-3′)应用脂质体介导方法转染到Hela细胞中,操作步骤严格按照说明书进行。转染48 h后,用TRIzol试剂提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,测定目的基因的表达量。转染分为siNC组和siMCM2组。

4.MTT实验检测细胞增殖能力:Hela细胞经37 ℃胰蛋白酶处理60 s,以3×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中。转染24 h后,向96孔板中加入20 μl MTT。每组重复3次。4 h后,弃去上清液,每孔中加入150 μl二甲基亚砜,37 ℃孵育10 min。继续培养48 h后,每孔加入10 μl MTT,再孵育2 h。用酶标仪检测570 nm波长处各孔内的吸光度(OD值)。转染分为空白对照组、miR-186-3p inhibitor组、miR-186-3p mimics组以及各自的对照组(NC inhibitor、NC mimics)。

5.Transwell实验检测细胞的侵袭能力:取各组细胞重悬,接种于Transwell小室上层(3×103个细胞/孔),用无血清的培养液培养;下层加入含10% FBS的培养液,孵育24 h。用棉签擦去Transwell上室细胞。下室以4%多聚甲醛固定后以0.1%结晶紫染色。随机计数5个视野中的迁移或侵袭细胞数。转染分组为NC组、miR-186-3p inhibitor组、miR-186-3p mimics组、siMCM2组。

6.双荧光素酶报告基因检测实验:根据Targetscan(www.targetscan.org)DB、starbase等网站预测miR-186-3p的潜在靶基因,结果发现MCM2 mRNA的3′UTR区为miR-186-3p的潜在靶基因。将MCM2的3′UTR区域片段插入到psiCHECK-2载体中,该载体为野生型(MCM2 3′UTR-WT)载体。设计针对MCM2 3′UTR“种子区”的突变引物,插入到载体多克隆位点中,载体命名为MCM2 mutant(MCM2 3′UTR-MUT)。突变型载体同样含有突变的MCM2 3′UTR结合位点。MCM2 3′UTR-WT、MCM2 3′UTR-MUT分别与miR-186-3p mimics、miR-186-3p inhibitor,以及各自的模拟物对照(NC mimics)和抑制物对照(NC inhibitor)两两组合共转染到Hela细胞中。转染后48 h,收集Hela细胞进行各组细胞萤火虫萤光素信号及海肾萤光素信号的检测,实验重复3次。取对数2×105个细胞/孔的HeLa细胞接种在24孔板中并培养24 h。当细胞密度增加50%时,按照Lipofectamine®2000说明书操作。转染分为miR-186-3p mimics+3′UTR-WT、miR-186-3p mimics+3′UTR-MUT组,设3个复孔。转染后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行操作,计算荧光素酶活性。

7.Western blot检测蛋白表达:按照试剂盒的操作说明,将提取的HeLa细胞在冰上裂解30 min。将细胞中提取的蛋白质用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶分离,然后转移到PVDF膜上。转膜结束,将膜浸入封闭液(含5% 脱脂奶粉的TBS)中缓慢振荡后洗涤;加入兔抗人MCM2抗体(批号ab245303),4 ℃缓慢振荡过夜;加入HRP标记的二抗(1∶10 000稀释),室温缓慢振荡2 h后洗涤;以β-actin作为内参,目的蛋白表达水平=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。实验重复3次。

四、统计学方法

结 果

一、miR-186-3p和MCM2在宫颈癌及癌旁正常组织中的表达水平

与癌旁正常组织比较,宫颈癌组织miR-186-3p相对表达水平明显下降[(0.58±0.31) vs (1.26±0.47)],差异有统计学意义(P<0.05)(图1A);MCM2相对表达水平显著高于癌旁正常组织[(2.22±1.32) vs (1.05±0.63)],差异有统计学意义(P<0.05)(图1B)。

二、宫颈癌组织中miR-186-3p与MCM2相关性分析

相关性分析显示,宫颈癌组织中miR-186-3p和MCM2的相对表达量呈负相关(r=-0.984,P<0.05)(图2)。

图2 miR-186-3p、MCM2在宫颈癌组织中表达水平的相关性分析

三、Hela与HcerEpic细胞中miR-186-3p和MCM2的表达情况

与正常宫颈上皮细胞比较,HeLa细胞中miR-186-3p表达水平明显降低[(1.00±0.23) vs (0.31±0.17)],差异有统计学意义(P<0.05)(图3A);而MCM2表达水平明显高于正常宫颈上皮细胞[(0.50±0.03) vs (5.47±0.35)],差异有统计学意义(P<0.05)(图3B)。

A:qPCR结果表明宫颈癌组织的miR-186-3p的相对表达水平显著低于正常组织;B:qPCR结果表明宫颈癌的MCM2相对表达水平显著高于正常癌旁组织图1 miR-186-3p、MCM2在宫颈癌旁组织及宫颈癌组织中的表达情况

四、Hela细胞中siMCM2的表达情况

利用siRNA验证MCM2在宫颈癌中的功能。与siNC组相比,siMCM2组的MCM2表达显著下降[(1.14±0.04) vs (0.28±0.02),P<0.05],见图4。

图4 HeLa细胞中siMCM2表达水平

五、miR-186-3p靶向调控MCM2

生物信息学预测结果显示,miR-186-3p对MCM2具有靶向调控作用(图5A)。双荧光素酶活性结果表明miR-186-3p mimics和MCM2 3′UTR-WT共转染Hela细胞后,荧光素酶活性较NC mimics组明显受到抑制[(0.49±0.05) vs (1.04±0.04),P<0.05],而miR-186-3p mimics和MCM2 3′UTR-MUT共转染细胞后,荧光素酶活性与对照组相比没有变化[(1.03±0.04) vs (1.03±0.04),P<0.05,图5B]。与对照组比较,转染miR-186-3p mimics后,miR-186-3p的表达明显升高[(1.94±0.08)vs (0.11±0.06),P<0.05,图5C]。转染miR-186-3p mimics可抑制Hela细胞中MCM2 mRNA的表达[(0.99±0.06) vs (0.31±0.08),P<0.05,图5D]。Western blot结果显示,与NC mimics组相比,miR-186-3p mimics组中MCM2蛋白的表达量显著降低[(0.28±0.02) vs (1.15±0.04),P<0.05,图5E]。结果表明,miR-186-3p和MCM2具有靶向调节作用。

A:HeLa细胞中的miR-186-3p的相对表达量显著低于HcerEpic细胞;B:HeLa细胞中的MCM2的相对表达量显著高于HcerEpic细胞图3 HeLa和HcerEpic细胞中miR-186-3p和MCM2表达水平的比较

A:miR-186-3p与MCM2的靶向作用位点;B:荧光素酶实验验证 miR-186-3p与MCM2的靶向作用;C:miR-186-3p mimics增加miR-186-3p的表达量;D:miR-186-3p mimics下调MCM2的相对表达量;E:蛋白印迹法检测MCM2蛋白的相对表达量图5 验证miR-186-3p的作用靶点及检测MCM2的表达情况

六、miR-186-3p对宫颈癌细胞增殖的影响

细胞增殖实验测定了转染不同miR-186-3p的Hela细胞在不同时间的增殖活性,见表1。根据混合效应模型的分析结果,不同转染组间的细胞增殖活性存在显著性差异(F=52.53,P<0.001)。细胞的增殖活性受转染后培养时间的影响(F=890.10,P<0.001)。在平衡时间因素之后,转染miR-186-3p mimics组的细胞增殖活性显著低于对照组(t=-5.60,P=0.003)。转染miR-186-3p inhibitor组的细胞增殖活性显著高于对照组,差异均有统计学意义(t=20.65,P<0.01);转染siMCM2细胞增殖活性显著低于对照组,差异有统计学意义(t=4.42,P=0.013)。

表1 各组不同时间点细胞增殖结果比较

七、miR-186-3p和MCM2对细胞迁移的影响

Transwell实验结果显示,miR-186-3p inhibitor组和NC组的侵袭细胞个数分别为(81.07±2.61)和(39.96±0.50),miR-186-3p inhibitor组明显增多(P<0.05);miR-186-3p mimcs组和siMCM2组的侵袭细胞个数分别为(26.02±2.51)和(10.60±2.16),siMCM2组的侵袭细胞数显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),见图6。

讨 论

宫颈癌是常见的恶性肿瘤之一,发病后死亡率极高[9]。HPV感染已被证明是导致宫颈癌的主要原因,但某些致癌基因也会促进宫颈癌的发生与进展。早期宫颈癌患者的临床标准治疗是子宫切除术、淋巴结切除术、化疗或放疗。宫颈癌晚期患者通常接受近距离放射治疗[10]。然而,这些临床治疗方法在预防宫颈癌发生与发展方面均存在弊端,且无法预防宫颈癌的复发。因此,迫切需要了解导致宫颈癌发生和进展的潜在分子机制。有研究表明,宫颈癌细胞的抑制可能受到各种miRNAs的影响,如miR-21、miR-29a、miR-451a和miR-106b-5p[11-12]。另有研究表明,miR-186可参与多种细胞过程,包括细胞增殖、迁移和凋亡的全过程,且miR-186在多种癌症中具有调控作用[13],如急性髓系白血病、非小细胞肺癌、口腔鳞状细胞癌和肝细胞癌。在一项研究中发现miR-186-3p可抑制乳腺肿瘤的发展[5],而在另一项研究中发现miR-186-3p可降低细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)的表达,并影响癌细胞的细胞周期调节[14]。然而,宫颈癌中miR-186-3p的表达特征与宫颈癌发生的关系尚不清楚。

MCM2是一种稳定的异六聚体,对DNA复制的调节至关重要[15]。在G1阶段,复制起点与起点识别复合物相互作用,诱导细胞分裂周期、染色质、DNA复制因子1和MCM2-7的顺序募集,形成复制前复合物。在S期,细胞周期激酶对MCM复合物的激活触发了DNA复制的启动[16-17]。有动物实验研究表明小鼠体内MCM2表达水平的降低会导致淋巴瘤的发生[18]。另有研究证实,MCM2在口腔癌、胃癌、结肠癌和乳腺癌的发生、发展中具有重要作用,提示其可能是一种更可靠的标志物[19]。与低度恶性肿瘤相比,MCM2在卵巢腺癌中的表达水平明显较高,而高度表达的MCM2在恶性肿瘤中与预后不良相关[20]。

A:HeLa细胞转染后的细胞侵袭情况(结晶紫染色,×400);B:HeLa细胞转染后的细胞数图6 转染miR-186-3p inhibitor、miR-186-3p mimcs、siMCM2对HeLa细胞侵袭能力的影响

本研究结果表明miR-186-3p在宫颈癌组织中低表达,而MCM2在宫颈癌组织中高表达(P<0.05)。MCM2具有促进宫颈癌细胞增殖的作用,并且我们发现miR-186-3p与MCM2的表达呈负相关;双荧光素酶实验和Western blot结果证实miR-186-3p和MCM2具有靶向调控作用。同时,Western blot结果显示转染miR-186-3p mimics可抑制MCM2蛋白表达,转染miR-186-3p inhibitor后增强了宫颈癌细胞的增殖及侵袭能力。MCM2在Hela细胞中表达明显升高,且其在肿瘤组织中的表达高于非肿瘤组织,敲除MCM2可减弱宫颈癌细胞的增殖。这些结果表明MCM2可促进宫颈癌的发展。

综上所述,miR-186-3p在宫颈癌组织中低表达,通过靶向调控MCM2基因抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭进而影响宫颈癌的进展。本研究为宫颈癌治疗提供了新的见解,但仍存在一些局限性,如未进行关于细胞表型“侵袭能力”实验以及检测相关蛋白表达。因此,未来的研究应该重点关注参加该信号通路的关键蛋白质。