原花青素在多孔薄膜中实现高效加载与长效释放的研究

王硕,张聪聪,姚晓敏

(浙江药科职业大学,浙江 宁波 315100)

原花青素是一类含双黄酮衍生物的天然多酚类化合物,在自然界中分布广泛,可从果蔬、花朵和树皮中提取[1-2]。原花青素的结构中含有较多的酚羟基,结合其特定的分子立体化学结构,使得原花青素具有极强的抗氧化活性,可实现对人体内自由基的有效清除,预防由氧化应激引起的各种疾病,如心血管疾病等[3-5]。同时已有大量研究证明原花青素可预防和治疗癌症,是一类重要的天然来源药物分子[6]。然而,由于原花青素在人体中主要在小肠被吸收,如果过早被口腔或胃中消化液破坏会大大降低其在机体内的药物活性[7]。因此,如何设计一个可控释放的载体系统实现原花青素分子的长效传递成为一个重要的研究课题[8-10]。本研究以聚合物多孔薄膜作为表面介导的载体,实现了原花青素的高效加载和长效释放,并探讨其中的释放机制。

1 仪器与试剂

偏光显微镜(Imager.A2m)和激光共聚焦显微镜(LSM 780),都产自德国蔡司公司;场发射扫描电子显微镜(FEI,Nova NanoSEM 650,USA);紫外可见双光束分光度计(Mapada UV6100s),产自上海美谱达仪器有限公司;超声波乳化仪(HN-500),产自上海汉诺公司。

聚苯乙烯(polystyrene,PS,Mw=1.92 × 105)和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)均购自Sigma-Aldrich公司;原花青素购自北京索莱宝科技有限公司;十二烷基二甲基溴化铵(didecyldimethylammonium bromide,DDAB)购自Aladdin公司;三氯甲烷购自杭州高晶化工;去离子水(18.2 MΩ cm-1)由超纯水仪(HK Super PW)制得。

2 方法

2.1 聚合物平面薄膜的制备 将PS以10 mg·mL-1的浓度溶解在三氯甲烷中配制为溶液,在低环境湿度(25 ℃,RH≈25%)的条件下将PS溶液浇筑在干净的固体基底上,待三氯甲烷挥发完后,在基底上形成厚度约为10 μm的聚合物平面膜片,然后放置在干燥皿中备用。

2.2 聚合物多孔薄膜的制备和原花青素的加载 在通过乳液加载原花青素并浇筑制备多孔膜的试验中,将DDAB作为乳化剂以0.5 mg·mL-1的浓度溶于三氯甲烷,另将原花青素以80 mg·mL-1的浓度溶于去离子水后与三氯甲烷溶液以一定比例(本文中使用了0.6%、1%、2%、2.6%、3.6%和4%共6种含水量来配制乳液)混合,用超声乳化仪对混合液实施超声乳化20 min,制备得到反相乳液。然后将反相乳液在潮湿的环境中(25 ℃,RH≈75%)浇筑在已经制备好的PS平面膜上。待三氯甲烷和水挥发完毕后,将所获得的多孔薄膜放置在干燥皿中进行进一步干燥。

在通过浸泡加载原花青素的试验中,首先按照前述步骤(区别是没有加入原花青素)制备得到多孔膜样品,然后将其置于原花青素的去离子水溶液中,在避光室温条件下浸泡10 h,通过物理扩散吸附过程实现原花青素在多孔膜样品内的浸泡加载。取出后放置在干燥皿中进行进一步干燥。

2.3 原花青素的释放 采用索莱宝的植物原花青素含量检测试剂盒(货号:BC1355),按照试剂盒说明书检测溶液中原花青素浓度,检测波长为500 nm。首先利用紫外可见双光束分光度计获得基于已知浓度(0.078、0.156、0.312 5、0.625、1.25、2.5和5 mg·mL-1)的原花青素的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液的标准曲线,根据标准曲线计算药物加载薄膜所释放的原花青素浓度。药物释放分析试验在37 ℃下进行,将加载原花青素的薄膜浸入PBS缓冲液(pH 7.4)中。在预定的时间点,取出药物加载薄膜,按照试剂盒说明书用紫外可见分光度法对PBS释放液进行分析。取出的药物加载薄膜重新浸泡入新制备的PBS缓冲液中,继续释放至下一个时间点。释放测试持续28 d。通过将释放原花青素的累积量除以薄膜所加载的原花青素总量,计算原花青素释放的百分比。

3 结果

3.1 多层多孔薄膜的形貌调控 在本研究中,利用高湿度条件下溶剂浇筑致孔的方式来制备多孔聚合物薄膜。在这种基于水滴模板效应的材料制备过程中,为了实现高孔隙率的致孔效果以及亲水性药物加载的目的,反相乳液被用来代替传统的纯溶剂体系实施浇筑致孔[11-12]。而在多孔药物传递体系的设计中,多孔结构的形貌参数将直接影响药物释放的行为[13-18]。因此我们通过改变反相乳液配方体系,评价其对所获得多孔结构的影响,特别是对表面层膜孔之下的本体层内孔结构的影响。我们制备了水相含量为0.6%、2.6%和3.6%的反相乳液,并通过乳液浇筑制备得到相应的多孔载药薄膜。图1展示了3个条件下所制备的多孔样品的表面和截面形貌。从表面结构来看,3种条件下均获得了规则的蜂窝状阵列结构的多孔形貌。而随着乳液中水量的增加,表面膜孔尺寸随之增大,但多孔阵列的规则度和孔径的均一性均有所下降。而观察本体层截面结构,其多孔结构随着水量的提升更是有了极大的变化,从低水量条件下所产生的亚微米尺寸的无序孔隙结构(见图1d),变为中水量条件下的微纳尺寸复合多孔结构(见图1e),最后在高水量条件下,在本体层生成了与表面层膜孔的孔眼尺寸相当的微米尺寸大孔阵列(见图1f),表面的有序膜孔阵列与本体层的无序多层膜孔共同构成了有序/无序非对称的复合形貌。因此,通过反相乳液浇筑致孔的方法,成功在平面薄膜上制备得到了孔洞形貌可调的多层多孔载药聚合物薄膜。

a～c.表面光学显微镜照片;d～f.截面扫描电子显微镜照片;致孔乳液含水量:a和d.0.6%; b和e.2.6%; c和f.3.6%;标尺:a～c.10 μm;d～f.5 μm图1 由不同含水量的反相乳液所制备的多孔多层薄膜的表面光学显微镜照片和截面扫描电子显微镜照片

3.2 反相乳液加载水溶性组分可行性研究 为了表征水溶性组分在所获得的多孔多层膜片中的分布情况,我们使用FITC作为荧光标记物,代替原花青素加入水相中,利用浇筑致孔过程混入多孔薄膜,并通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察的方式进行荧光素分布的追踪表征。我们选取高含水量(3.6%)乳液配方条件下所制备的多孔膜片进行观察,从图2a可见,绿色荧光信号组成了环状阵列组装形貌,并且荧光环之间间隔明显,这种利用水滴模板过程结合反相乳液体系所获得的荧光环形貌已在前期文献被报道[19-22],证实了这种荧光分子在表面孔洞结构内壁处的选择性分布,而三维重构的CLSM数据(见图2b～c)则进一步确认了这种环状阵列形貌。同时三维重构数据显示荧光分子除了在表层的分布外,同时在本体层也实现了大范围的分布。

a.表面及截面的切层照片;b～c.不同角度的三维重构照片图2 FITC在多孔多层薄膜中分布的CLSM照片

3.3 反相乳液加载原花青素及其释放行为研究 前述结果证实了多层多孔聚合物薄膜的成功制备,以及水溶性组分可以通过致孔过程实现加载和选择性的空间分布。基于这一结果,我们进一步表征了加载了原花青素的多孔薄膜的药物分子释放行为。图3a是由图1所示的3类水油比条件下所获载药薄膜样品在28 d内的释放曲线图。为了区分不同类型的样品,用S1(使用1%含水量的乳液致孔获得)、S2(2%含水量)和S3(4%含水量)分别代表3类条件下具有不同形貌特点的3种样品。从结果中可以看到所有3种样品均在释放试验初期显示出快速释放的行为,在前8 h后均完成了20%～30%的释放比例,而在此之后S1～S3都显示出显著的持续释放行为,最终在长达28 d的释放试验结束时都还没有达到完全释放。其中S3在28 d后仅实现了64.92%的释放,是3种样品中实现了最长效释放效果的样品。为了进一步讨论释放过程的动力学机理,Ritger-Peppas模型被用以进行释放数据的拟合(见图3b),具体请见讨论部分。作为对照,4种利用浸泡过程后加载原花青素的多孔膜样品被用以开展原花青素的释放试验,图3c中S0、S1′、S2′和S3′分别是使用0%、1%、2%和4%含水量乳液所制备的多孔膜,在利用浸泡过程加载原花青素之后4种样品在前10 h后均完成了超过50%的释放比例,而在不到100 h后均达到完全释放。

4 讨论

在本研究中,利用高湿度环境中反相乳液浇筑的方法在薄膜材料表面实现多孔多层结构的制备。DDAB已被证明可辅助稳定用于浇筑制备多孔薄膜的反相乳液[22],本研究中同样使用了DDAB作为乳化剂配制反相乳液。综合之前的报道,在此过程中环境凝结水滴和乳液液滴均能够作为致孔结构模板实现多孔结构的构建[19-22]。通过控制乳液中的水相比例,从而获得乳液液滴在数量和尺寸上的调节,最终实现表层和本体层多孔结构的双重调节(如图1所示)。作为加载药物分子的主要作用结构,多孔形貌所具有的动态可控的属性将为进一步调控药物释放行为提供较好的基础[8-9]。试验结果(见图2)进一步证明,利用乳液液滴加载药物分子后直接参与致孔的方式可以实现药物分子在所形成多层多孔结构当中的均匀分布,甚至在上表面的规则孔洞阵列中实现选择性环状结构的分布形貌。这种在高比表面积基体中实现所封装药物分子定向分布的结果,非常有利于实现药物分子后续的长效释放。

图3所示的释放行为也证实了这种长效释放的效果。相比于浸泡加载的多孔薄膜样品所呈现的短时间快速释放(见图3c),通过乳液液滴直接加载的薄膜样品展示了极其优异的长效释放性能(见图3a)。而通过进一步对比S1～S3的样品释放行为,我们发现在所加载药物的量相同的条件下,含水量越高的乳液所制得的多孔薄膜药品显示出越长效的释放行为。这可以解释为在含水量较高的条件下,乳液液滴能够在本体层获得孔径更大和孔隙率更高的致孔效果并由此在本体层封装入更多的药物分子,有文献表明这种上层有序下层无序的多孔薄膜作为药物释放载体,本体层的结构更能起到储备药物实现缓释的作用,而上表面的规则孔眼结构则能有效地作为药物扩散的通路[23-24]。

为了进一步揭示释放动力学,我们用Ritger-Peppas方程(公式1)拟合了S3的释放曲线[25-26]。

(1)

式中:Mt是时间t释放药物的累积量;Minf是无限时间释放药物的累积量;k是动力学常数;n是与释放机制有关的释放指数。通过将释放数据代入公式1利用Origin软件进行数据拟合。如图3b中的拟合结果所示,n值小于0.5,S3释放行为与Ritger-Peppas模型可以实现很好的吻合,表明该药物释放行为遵循Fickian扩散机制[24]。使用Ritger-Peppas方程模拟的动力学结果表明,对于像原花青素这种水溶性药物分子,本研究中所获得的多孔多层薄膜是一种可实现长期缓慢释放效果的理想药物载体体系。

综上,本研究提出了一种针对原花青素药物分子实现长效缓释目的的药物载体体系,利用加载了原花青素的反相乳液进行薄膜表面浇筑的方式成功制备得到了具有多层多孔结构的药物加载多孔薄膜,并证实其可实现基于Fickian扩散机制的长效药物释放行为。本研究将为设计高效灵活的药物释放体系提供有效的参考。