基于水凝胶的核酸药物负载策略的研究进展

李成昊,何东升*,涂家生*

(1.中国药科大学药学院药用辅料及仿创药物研发评价中心,江苏 南京 210009;2.国家药品监督管理局药物制剂及辅料研究与评价重点实验室,江苏 南京 210009)

基因治疗是指通过对目标基因进行引入、敲除或者改变其表达等方式,以达到治疗或者预防疾病的目的[1]。根据对目标基因的操控方式,基因治疗主要有以下3种形式:①用健康基因替换导致疾病的突变基因;②敲除或沉默导致疾病的突变基因;③将新基因引入细胞以预防疾病[2]。核酸药物的类型主要包括质粒DNA(plasmid DNA,pDNA)、反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)、小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、微小RNA(micro RNA,miRNA)以及信使RNA(messenger RNA,mRNA)等[3]。随着基因治疗相关技术的发展,特别是近两年来,已有多款基因治疗药物获批上市,如用于遗传性甲状旁腺素淀粉样变性的Tegsedi、杜氏肌营养不良症的Vyondys 53和家族性部分脂肪营养不良的Waylivra等ASO类药物,用于原发性高草酸尿症1型的Oxlumo和成人原发性高胆固醇血症的Leqvio等siRNA类药物。此外,在新冠疫情肆虐的背景下,辉瑞/BioNtech的Comirnaty以及Moderna的Spikevax这两款mRNA疫苗也获批上市,开启了mRNA药物的新篇章。基因治疗的关键在于如何实现将核酸药物精准递送至靶部位,降低脱靶效应,最大程度地发挥核酸药物的疗效[4]。由于核酸药物易受到肝脏清除和核酸酶降解等因素的影响,因此核酸药物需要合适载体的介导递送,以保证有效的基因转染[5-6]。

1 核酸药物递送系统

根据基因递送载体的类型,可以将其分为病毒型基因载体以及非病毒型基因载体,病毒型载体尽管具有较高的转染效率,但其具有潜在的免疫原性、基因突变风险[7]和致癌风险[8]。而非病毒基因载体由于其具有较低的免疫原性、无内源病毒重组以及在递送较大基因时限制较少,正成为核酸药物递送系统的研究热点。非病毒基因载体系统需要克服递送过程中的诸多挑战:载体首先需要能够有效包载被递送的基因,减少或避免被核酸酶降解;然后在靶组织富集,并根据治疗的需要,释放出所携带的基因以发挥作用[9]。非病毒基因载体中目前应用最为广泛的是阳离子类基因载体,如阳离子聚合物和阳离子脂质体等。阳离子类基因载体可以通过静电吸附作用包裹压缩核酸形成纳米颗粒以保护核酸不被降解,同时促进载体内化进入细胞,最终实现有效转染[9-11]。然而,非病毒载体相比于病毒载体具有较低的转染效率,同时,其在肝脏以外的靶器官中的分布较少、滞留时间短,限制了非病毒载体的应用,常需要重复给药才能获得有效的基因治疗效果[12]。

基于非病毒基因载体的局部给药和长时间缓释是解决非病毒载体治疗作用相关问题的重要手段[13]。将基于非病毒基因载体的递送系统通过局部给药的方式使其定位于靶器官中,并通过特殊的载体设计使其在靶部位提供持续的基因治疗,可最大限度地减少其在非靶器官中的暴露,从而显著提高非病毒载体的安全性和基因治疗的疗效。另外,持续的基因治疗在再生医学和罕见病等领域具有良好的应用前景,例如血管生成和软骨生成[14]等,可持久地增强受损组织的修复。

因此,非病毒基因递送系统的选择应着重关注其体内稳定性、转染效率、靶向性,以确保基因治疗的有效性和安全性。在各类非病毒基因载体中,水凝胶系统由于其良好的生物相容性、高效的核酸药物负载能力和局部定位控制释放等优势,为核酸药物的递送提供了有效的工具。本文对近年来水凝胶系统作为核酸药物载体的研究进行探讨,并重点探讨基于水凝胶的核酸药物负载策略。

2 基于水凝胶的药物递送系统

水凝胶是一种由聚合物在水中通过交联所形成的亲水3D网络状结构[15]。它可以将高剂量非特异性分布的药物精准递送至特定部位,同时实现药物分子的持续控制释放[16]。水凝胶系统具备以下几个特点:①其结构中含有大量水分,使其可以模拟天然细胞外基质或组织的物理化学特性,同时有助于生物大分子的负载以及生物稳定性的保持[17];②水凝胶可以通过局部注射的方式对目标部位进行定点给药,具有天然的局部靶向特性以及优异的药物负载能力[18],被广泛应用于实体瘤和局部炎症等局部治疗中[19],可显著提高患者的顺应性;③水凝胶具有较好的生物相容性以及[15]机械强度,被广泛应用于组织修复等再生医学领域[20]。

近年来,水凝胶也被开发用于核酸药物的局部递送和控制释放,来避免对其他组织的潜在副作用以提高体内疗效。由于核酸药物表面带正电荷,如何将其均匀地负载于水凝胶中并实现可控的缓慢释放是这类局部基因递送系统亟须解决的问题。目前基于水凝胶的基因递送系统主要有两种递送策略(见图1),一种是由水凝胶直接负载核酸药物;另一种则是先将核酸药物与载体形成复合物,再利用水凝胶对复合物进行递送。

3 水凝胶介导的核酸药物负载策略

核酸药物中大量的磷酸基团使其携带负电荷,因此阳离子水凝胶最早被应用于核酸药物的递送。阳离子水凝胶基质结构中的阳离子基团可以通过静电吸附作用与带负电的核酸药物结合形成水凝胶-核酸复合物,以达到负载核酸药物的目的,同时强烈的静电吸附作用还可以实现核酸的缓释[21]。除了最常用的静电吸附作用,近年来研究者们开始探索新的核酸负载策略,如通过对核酸药物或者水凝胶材料进行结构修饰来赋予其新的物理化学特性,从而借助共价结合或者疏水作用等将核酸药物装载于水凝胶网状结构中。

3.1 静电吸附作用 静电相互作用是目前大多数核酸药物递送载体负载核酸药物所依赖的主要作用力,具有足够的正电荷密度的聚合物载体(如聚乙烯亚胺和壳聚糖等)可以与带负电的核酸形成复合物[22-23]。Ma等[24]使用可注射热敏壳聚糖-甘油磷酸钠水凝胶直接负载si-RANK(靶点为RANK的siRNA,主要用于抑制破骨细胞成熟),实现了si-RANK在体外长达9 d的持续释放以及持续的基因沉默,在给药后的第9 d基因沉默效率仍可达到90%,体内荧光成像显示该负载si-RANK的水凝胶可以在注射部位停留至少7 d,显著增强了siRNA治疗的靶向性。虽然在体外具备优异的缓释效果,但体内研究发现,该制剂对小鼠注射给药后36 h内就有80%的siRNA突释,这意味体内可能存在加速壳聚糖降解的物质,Lee等[25]等通过酶降解实验发现体内的溶菌酶会显著促进壳聚糖的分解,因此在选用壳聚糖进行体内基因递送时应该注意核酸在体内外释放行为的一致性问题。Krebs等[26]使用掺有阳离子聚合物(壳聚糖和聚乙烯亚胺等)的海藻酸盐水凝胶递送siRNA,体外释放实验发现壳聚糖和聚乙烯亚胺均会显著降低siRNA的释放速率,这可能是核酸药物与阳离子聚合物之间的强烈静电相互作用所导致的。

因为壳聚糖等天然阳离子聚合物在体内易被降解,研究者们开始通过对非阳离子聚合物进行阳离子化修饰,以获得更高且可控的正电荷,从而实现对核酸药物的高效负载和控释,这一修饰策略极大地扩展了基于水凝胶的基因递送的材料库。Nguyen等[27]通过酯键将线性聚乙烯亚胺(LPEI)共价结合到葡聚糖(DEX)水凝胶骨架结构中,阳离子化后的葡聚糖水凝胶以静电吸附作用直接递送裸露siRNA并实现长达14 d的可控释放(见图2),体外释放14 d后基因沉默效率达到88.44%。作者发现水凝胶中共价结合的LPEI的越多,siRNA的突释率越小,随着LPEI与DEX之间相连的酯键的断裂,LPEI可以与siRNA形成复合物进一步提高转染效率。

图2 共价连接有LPEI的葡聚糖水凝胶递送siRNA示意图

明胶是一类具有高生物相容性的天然高分子物质,它可以通过受体介导的内吞途径进入细胞[28],以明胶为基质的水凝胶是性能优秀的药物载体,但是因为其表面缺乏足够的正电荷,限制了其作为基因载体的应用。Chun等[29]对明胶进行了阳离子化修饰,将酪胺(Tyr)与明胶(Gtn)共轭从而起到电荷调节和交联作用,酪胺上的带电氨基可以中和明胶结构中带负电荷的羧基,通过调节共轭的酪胺的含量,可以人为地调节明胶水凝胶的表面电荷,将改性前的明胶水凝胶的表面电荷从-3.25 mV最高可提升至+6.29 mV,为明胶水凝胶基质创造了带净正电荷的环境,实现对si-SPARC(靶点为SPARC的siRNA,主要用于治疗纤维化疾病)的负载(见图3)。酪胺改性后的明胶水凝胶(Gtn-Tyr)在降解过程中与si-SPARC通过静电吸附作用形成复合物,进一步增强了si-SPARC的细胞摄取。体外释放实验显示,改性后的明胶水凝胶可以实现长达7 d的释放,改性后的表面电荷越高,Gtn-Tyr与si-SPARC之间的静电吸附作用越大,其24 h突释率越小。因此,通过调节阳离子水凝胶内正电荷的数量可以加强对核酸的束缚,从而减缓核酸药物的释放,降低突释率,实现对核酸药物的可控缓慢释放。

图3 Gtn-Tyr水凝胶的合成过程及降解后细胞内化示意图

3.2 共价结合作用 裸露的核酸药物在阳离子水凝胶中的释放行为主要受到其在水凝胶中的分布、与阳离子载体的静电吸附作用、水凝胶的降解以及核酸药物从水凝胶孔道中的扩散等因素的影响,上述因素都会限制基于水凝胶系统的核酸药物的精确时空递送。通过对核酸药物进行化学结构修饰,使其可以共价结合到水凝胶的基质结构中,可实现核酸药物在水凝胶中的均匀分布以及可控释放。

Nguyen等[30]对si-GFP末端进行巯基化修饰,将其通过β-硫醚酯键共价连接到葡聚糖水凝胶中。在最初的24 h里,物理包埋si-GFP的葡聚糖水凝胶实验组体外累积释放率即超过85%,而与si-GFP共价结合的葡聚糖水凝胶实验组的体外累积释放率仅为30%,并且实现了长达14 d的缓慢释放。共价键对核酸药物的高束缚力大大降低了其在水凝胶中突释效应,其释放行为主要由共价键的断裂速率所影响。然而作者发现,释放出的si-GFP很难转染进入细胞,这可能是因为核酸与水凝胶之间的共价键断裂后形成了末端带羧基的si-GFP,影响了si-GFP的生物活性。因此作者将si-GFP通过二硫键以及酯键连接到葡聚糖水凝胶中,使si-GFP以末端携带巯基或者羟基的形式释放,但基因沉默效率仍仅能达到化学修饰前的20%～70%。随后,Kim等[31]同样将si-noggin(靶点为noggin的siRNA,主要用于增强成骨能力)通过二硫键及酯键共价结合到将壳聚糖水凝胶的骨架结构中(见图4),体外释放实验显示该策略显著降低了si-noggin在三维网状结构中的突释率,实现了si-noggin长达14 d的可控缓慢释放,同时释放出的si-noggin具备足够的生物活性,14 d内均观察到足够的基因沉默效率。

图4 共价结合有siRNA的壳聚糖水凝胶合成示意图

将核酸共价结合到水凝胶的基质结构中,可以显著增强水凝胶对核酸的负载能力,使核酸均匀分布于水凝胶的基质骨架结构中,核酸的释放主要通过核酸和水凝胶骨架聚合物之间共价键的断裂来控制的,因此,这种负载策略可以实现核酸药物的可预测的缓慢释放。然而,该策略需要对核酸进行化学结构修饰,共价结合在水凝胶结构中的核酸在共价键断裂后是否具备足够的生物活性是限制该策略的主要障碍。

3.3 疏水相互作用 由于大量磷酸基团的存在,核酸通常是亲水的,若要将核酸以疏水相互作用的形式负载于水凝胶基质中,则需要对核酸进行疏水化修饰。对核酸末端进行胆固醇化修饰是一种常见的疏水化策略,经胆固醇修饰后的核酸可以在体内外被内吞进入细胞[32-35],同时也可以显著提高核酸在体内的循环半衰期,提高核酸药物的疗效。近年来,已有多项研究将这类疏水化修饰后的核酸通过疏水作用力包埋于含有疏水腔的水凝胶中以达到缓释的目的。

环糊精(CDs)是一类由6、7或者8个葡萄糖单元分子相连接的环状寡糖,分别被称为α-、β-和γ-环糊精[36]。由于其具有表面亲水,内部空腔疏水的特性,被广泛用于药物递送系统中以克服诸如药物溶解性、生物利用度和稳定性等问题[37],因此可以将胆固醇化的核酸药物以客体疏水相互作用的方式负载于环糊精中来实现基因递送。Wang等[38]设计了一种由环糊精和金刚烷修饰的透明质酸水凝胶,发现经胆固醇修饰的miRNA-302(一种可促进心肌细胞增殖的miRNA)对CD表现出了较强的亲和力(Ka=2×103M-1),因此它可以在疏水力的作用下结合到水凝胶基质中广泛存在的疏水空腔中(见图5)。从体外释放实验来看,这种疏水作用力可以大大减缓miRNA的释放,使其释放周期达到3周,而在体内负载miRNA-302的水凝胶在给药14 d内均观察到了小鼠心肌细胞的强劲增殖。

图5 环糊精及金刚烷修饰的透明质酸水凝胶通过主客体疏水相互作用递送胆固醇修饰的miRNA示意图

除了利用环糊精的疏水空腔来负载胆固醇化的核酸之外,Bakker等[39]还设计了一种由末端脲基嘧啶酮功能化的聚乙二醇(UPy-PEG)构成的水凝胶,UPy单元可以通过4个氢键在水中二聚,导致UPy和PEG链中间的烷基间隔形成一个“疏水性口袋”,通过疏水作用力负载末端胆固醇化的siRNA(见图6)。经体外释放实验证明,经胆固醇修饰siRNA(siRNA-chol)的释放周期可以长达45 d,负载低浓度siRNA-chol的水凝胶在第1天出现了20%的突释,而在负载高浓度的siRNA-chol的水凝胶第1天的突释率则降至了10%,这说明末端疏水化的siRNA-chol分子对水凝胶基质结构中的疏水口袋具有非常强的亲和力,从而展现了较强的缓释能力。从水凝胶基质结构中释放出来的siRNA-chol由于末端胆固醇化仍然具有足够的生物活性,可以在没有转染试剂的帮助下自行进入细胞,维持足够的转染能力。在这种水凝胶-核酸复合物中,siRNA-chol的释放动力学主要取决于siRNA-chol与水凝胶网络之间的疏水结合力而不是siRNA-chol在水凝胶中的扩散行为。

图6 具有“疏水口袋”的Upy-PEG水凝胶通过疏水相互作用递送胆固醇修饰的siRNA

表1 基于水凝胶的核酸药物负载策略总结

核酸末端的胆固醇化可以使核酸部分疏水化,由此可以利用疏水力将其结合到含有疏水空间的水凝胶网络中,以实现长时间的缓释。核酸的胆固醇化还加强了核酸本身进入细胞的能力,避免了阳离子转染试剂的细胞毒性。这种无需阳离子转染试剂即可在水凝胶中实现超长时间缓释的策略可以显著提高核酸药物临床应用的安全性。

4 总结与展望

水凝胶在需要多次给药的基因治疗中具有广阔的应用前景,如何将核酸药物均匀且可响应性的负载于水凝胶中是研究的难点。将核酸药物通过静电吸附、共价结合或疏水相互作用等直接负载于水凝胶体系中为基于水凝胶系统的基因递送提供了解决方案,表1总结了常见的基于水凝胶的核酸药物负载策略。然而,研究表明将核酸药物直接负载于水凝胶中可能无法保证其转染效率,从而影响治疗效果。因此,近年来研究者们开始广泛研究利用水凝胶系统负载核酸载体复合物。相比直接递送核酸药物,这类复合递送系统为核酸药物提供了良好的稳定性、转染效率、细胞摄取能力以及更可控的缓释能力,为基于水凝胶体系的核酸药物的负载提供了新的解决方案。但该类复合递送系统的临床转化仍面临一些亟待解决的问题,比如:负载核酸的载体使整个水凝胶系统处方组成更加复杂,制备难度加大;受水凝胶和核酸载体复合物的降解行为的双重影响,使得核酸药物的释放行为难以预测和控制;核酸载体复合物在水凝胶网络中的分布不均一等。因此,在未来的研究中,还需要重点在以下几个方面进行探索:继续寻找低毒且能高效转染的核酸载体材料;充分利用核酸载体复合物,以及该复合物与水凝胶系统的相互作用,从而避免其在水凝胶中聚集而分布不均的问题;开发更多可智能响应的载体纳米载体,以实现核酸药物在水凝胶系统中更为可控和可预测的缓慢释放,最终实现更高效精确的局部靶向治疗。水凝胶是目前进行局部基因治疗最理想的工具之一,对基于水凝胶的基因递送系统进行更深入的研究,有望在疾病预防、实体瘤治疗以及再生医学领域方面取得突破,促进基因治疗更进一步的发展。