诃子砂烫炮制工艺及砂烫诃子中鞣花酸提取工艺研究

郝季,鞠成国,张强,安悦言,王巍

(辽宁中医药大学药学院,辽宁 大连 116600)

诃子为使君子科植物诃子(TerminaliachebulaRetz.)或绒毛诃子(T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.)的干燥成熟果实[1]。古籍记载,诃子“生用敛肺利咽,煨熟固肠止泻”[2]。化学研究表明,诃子中主要含有鞣质类、多酚类、三萜类及多糖类;其中鞣质类约占总含量的23.60%～37.37%[3],主要为可水解的没食子鞣质和鞣花鞣质,前期研究表明,诃子经炮制后其所含鞣质类成分一定程度向没食子酸和鞣花酸转化。鞣花酸是一种多酚二内酯,具有抗菌、抗炎、抗氧化等多种药理作用[4]。前期药理研究表明,诃子炮制后治疗溃疡性结肠炎作用增强,该作用与鞣花酸含量增高有关[5]。溃疡性结肠炎的临床症状表现为黏液脓血便、腹泻、腹痛及里急后重等,与中医学中“肠澼”相对应[6],而诃子煨熟固肠止泻,主要用于肠澼的治疗,因此试验结果提示诃子炮制后鞣花酸含量增高可能是其“煨熟固肠止泻”的原因之一。

古籍中记载的诃子炮制方法多为“煻灰火煨”,现代炮制方法主要有炒法、麸煨法、砂烫法;其中砂烫法可通过河砂包埋传递热量,这与古代的“煻灰火煨”最为接近。此研究以鞣花酸为指标优化诃子砂烫炮制工艺参数以及砂烫诃子中鞣花酸提取工艺参数,为解析诃子炮制原理提供实验依据,并为诃子的临床应用及抗溃疡性结肠炎有效药物的开发奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 主要仪器 1100高效液相色谱系统(美国Agilent公司);FA1004B分析天平(上海精密科学仪器有限公司);XMTD7000电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

1.2 材料 诃子药材,产地广西,购于河北安国药材市场,经辽宁中医药大学药学院翟延君教授鉴定为使君子科植物诃子(T.chebulaRetz.)的干燥成熟果实;鞣花酸对照品购自成都曼斯特生物科技有限公司(含量测定用,纯度>98%,批号为MUST-14031010);甲醇为色谱纯,乙醇、甲酸为分析纯,水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 HPLC含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Dikma Platisil(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相:甲醇-水-甲酸(45∶55∶0.2);体积流量1 mL·min-1;等度洗脱。柱温30 ℃;检测波长270 nm,进样体积10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的鞣花酸对照品适量,加甲醇配制成对照品贮备液。精密吸取贮备液适量,配制得含鞣花酸0.007 667 mg·mL-1的对照品溶液,备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 取砂烫诃子药材粉碎,过65目筛,取0.1 g,精密称定,置50 mL具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定重量,超声处理30 min,取出,放凉,再次称重(若有减失,以甲醇补足失重),滤过,取续滤液,稀释5倍,经0.45 μm的微孔滤膜滤过,即得。

2.1.4 专属性试验 取甲醇空白溶剂、供试品溶液和对照品溶液,分别按“2.1.1”项下色谱条件,记录HPLC图。甲醇空白图谱与供试品、对照品图谱中鞣花酸相应的保留时间无其他峰干扰,说明色谱专属性良好,详见图1。

A.供试品溶液;B.对照品溶液图1 专属性试验色谱图

2.1.5 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液适量,以甲醇溶解并逐步稀释,使得鞣花酸浓度分别为38.33、19.17、9.58、4.79、2.40、1.20、0.60 μg·mL-1,按“2.1.1”项下色谱条件进样分析,记录峰面积。以质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)绘制回归方程。得到线性方程Y=87 435X-4.054,r=0.999 8。结果表明鞣花酸在质量浓度0.60～38.33 μg·mL-1内与其峰面积线性关系良好。

2.1.6 精密度试验 取“2.1.3”项下供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次,得鞣花酸峰面积的RSD为1.46%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取按“2.1.3”项下供试品溶液,于室温放置0、2、4、8、12、24 h,按“2.1.1”项下色谱条件进样,得鞣花酸峰面积的RSD为0.08%(n=6)。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。结果,鞣花酸的含量为33.07 mg·mL-1,RSD为0.87%(n=6)。表明该方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 取诃子粉末6份各0.05 g,精密称定,加入相当于样品中成分含量100%鞣花酸对照品,按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。结果,鞣花酸的平均回收率为 99.12%,RSD为0.46%(n=6)。

2.2 诃子砂烫炮制工艺优化

2.2.1 正交试验与结果 以鞣花酸含量为考察指标,选择炮制温度(A)、炮制时间(B)、翻埋频率(C)为考察因素,采用L9(34)正交表进行设计。诃子炮制工艺因素水平表见表1,正交试验结果见表2,方差分析结果见表3。

表1 诃子炮制工艺正交因素水平表

由表2可知,各因素对鞣花酸含量影响大小顺序为 A>C>B,由表3可知,3个因素各水平之间均无显著差异(P>0.05)。结合直观分析,炮制温度(A)在260 ℃和280 ℃鞣花酸含量相差不大,从节约能源考虑,选用260 ℃即可;炮制时间为第2水平即6 min、翻炒频率为第3水平即40次/min,鞣花酸含量最大。因此,确定最佳工艺为A2B2C3,即炮制温度260 ℃,炮制时间6 min,翻埋频率40次/min。

表2 诃子炮制工艺正交试验直观分析

表3 诃子炮制工艺正交试验方差分析结果

2.2.2 炮制工艺验证试验 取3份诃子药材各300 g,按“2.2.1”项下最佳工艺条件进行炮制,按“2.1.3”项下条件进行提取验证。结果显示,鞣花酸含量分别为32.13、32.33、33.04 mg·g-1,RSD为1.47%(n=3),表明该炮制工艺稳定,重复性良好。

2.3 诃子炮制后鞣花酸提取工艺优化

2.3.1 正交试验设计 以出膏率、鞣花酸提取量、膏中纯度为考察指标,选择粒径(A)、液料比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)为考察因素,以95%乙醇为溶剂,采用冷浸法按L16(45)正交表进行试验。鞣花酸提取工艺的因素水平表见表4。

表4 鞣花酸提取工艺正交因素水平表

2.3.2 层次分析(AHP)法确定权重系数 试验采用1～9标度法对出膏率、鞣花酸提取量、膏中纯度这3项指标进行两两比较评价其重要性[7],各指标成分的评价标准见表5,因鞣花酸提取量与膏中纯度同样重要,相对权重记为1,鞣花酸提取量相对于出膏率稍重要,相对权重记为3,指标层次比较判断优先矩阵见表6。得到出膏率、鞣花酸提取量、膏中纯度的权重系数分别为0.142 9、0.428 6、0.428 6;一致性比率因子CR=CI/RI=0.000<0.10,具有一致性,表明权重系数有效。

表5 评价指标各层次评分标准

表6 指标层次比较判断优先矩阵

2.3.3 指标重复性相关(CRITIC)法确定权重系数 CRITIC法属于客观赋值法,确定指标权重时首先将数据进行归一化处理,后用SPSSAU软件进行CRITIC分析,得到出膏率、鞣花酸提取量、膏中纯度权重系数分别为0.368 2、0.197 3、0.434 5。

2.3.5 3种权重分析法比较 分别用AHP、CRITIC、AHP-CRITIC 法的权重系数对正交试验结果进行综合评分,结果见表7。通过SPSS 17.0软件对得到的综合评分进行相关性分析,结果AHP法与CRITIC法相关系数为0.992,AHP法与AHP-CRITIC法为0.991,CRITIC法与 AHP-CRITIC法为0.969,三者间的相关性均显著(P<0.05),表明3种评分结果具有一致性[8]。对AHP法与CRITIC法的权重系数进行相关系数分析,相关系数为-0.247,呈负相关,其相关性不显著(P>0.05)。AHP-CRITIC法综合了AHP法和CRITIC法优点,平衡了主观因素和客观因素,所得的指标权重更可靠、更合理,因此选用AHP-CRITIC进行综合权重评分[9]。

2.3.6 正交实验结果与分析 根据AHP-CRITIC法的权重系数进行综合评分,采用SPSS 17.0软件进行数据分析,见表8～9。

由极差分析可知,各因素对鞣花酸提取工艺的主次为D>B>C>A。由方差分析可知,4因素各水平之间均无显著性差异(P>0.05)。根据直观分析结果确定最佳提取工艺为A4B3C4D4,即粒径120目,液料比10∶1倍,提取时间24 h,提取次数4次。

表7 3种权重系数综合评分

表8 正交试验综合评分直观分析

表9 正交试验方差分析结果

2.3.7 提取工艺验证试验 取3份按“2.2.3”工艺炮制后的诃子20 g,其中1#、2#、3#按“2.3.6”项下最佳工艺条件进行提取。由于正交试验最优工艺为提取4次,验证试验中同时做了减少提取次数的比较验证(4#),用于考量减少提取次数缩短工时的可能性。结果表明按最佳工艺进行提取综合评分为99.4,RSD为0.19%(n=3),表明该提取工艺稳定,重复性良好;提取3次的验证试验结果综合评分为79.6,表明减少提取次数对提取效率产生较为显著的影响,因此以提取4次为宜。验证试验结果见表10。

表10 提取工艺验证试验结果(n=3)

3 讨论

3.1 工艺考察 对砂烫诃子炮制工艺中炮制温度、炮制时间进行了考察;发现炮制温度260 ℃、炮制时间6 min鞣花酸含量最高,可能是由于炮制温度过高、炮制时间太长使其发生炭化使鞣花酸含量降低。

鞣花酸提取工艺中对提取方式、提取溶剂、粒径、液料比、提取时间进行了考察,发现采用冷浸法以95%乙醇为提取溶剂、粒径120目、液料比10∶1、提取24 h,鞣花酸含量最好。

3.2 层次分析 提取工艺优化中选取出膏率、鞣花酸提取量和膏中纯度3个指标进行评价,采用层次分析法和CRITIC法优化各指标的权重系数。层次分析法属于主观赋值法,可以将复杂问题进行定量、定性分析,分析影响因素,划分影响因素组别,建立判断矩阵,得出不同方案重要性程度的权重,为最佳方案的选择提供依据[10]。CRITIC法属于客观赋值法,是定量的分析方法,通过数据自身携带的信息分析指标间的客观规律,并量化指标间的关系,确定权重,使计算结果更加合理,但未能考量各指标的轻重关系,所以最终选用AHP-CRITIC法与正交试验结合来确定最优工艺[11]。

4 结论

在单因素试验基础上,筛选出诃子砂烫炮制工艺的重要影响因素并采用正交试验设计优化诃子砂烫炮制工艺参数,并验证炮制工艺可行性。在单因素试验基础上运用正交试验设计优选砂烫诃子鞣花酸提取工艺,并对鞣花酸提取工艺进行验证。所得诃子砂烫炮制工艺及砂烫诃子中鞣花酸提取工艺稳定可靠,可用于诃子的炮制及鞣花酸的提取。