肥胖相关代谢性内毒素血症对精子畸形率的影响因素分析

刘春辉 朱晨 陕文生 王志强 王海 周于娜 李少君 金莉娅

肥胖是导致男性生育力降低的高危因素之一[1-5]。现有研究表明,夫妻当中仅男方为肥胖者,参与试管受孕(IVF)辅助妊娠,最终活产率比非肥胖男性参与的IVF更低[6,7]。肥胖可使男性精子数量、活力、顶体酶功能受损的发生率升高,并有更大概率引发男性因素造成的女性复发性流产出现[8,9]。摄食过度、运动过少、选择高能量食品、遗传因素、内分泌因素、代谢因素是肥胖的诱因,同时也是男性生育力降低的诱因。一些生活中的混杂因素也间接影响了男性生育力。肥胖导致男性生育力降低的高危因素在不断的被发现,但肥胖导致的代谢性内毒素血症尚未被探讨过,本研究旨在探讨与肥胖相关的代谢性内毒素血症是否对精子畸形率产生影响,并寻找相关的危险因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2021年1～12月在我院就诊的男性患者684例,参照第五版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》,经精子形态学评估判断为畸形精子症者(正常形态精子占比<4%)453例作为观察组,精子无异常者231例作为对照组。排除标准:存在睾丸损伤、隐睾症或Klinefelter综合征;3个月内服用过皮质类固醇、鱼油、非甾体类抗炎药、益生菌、抗生素、人绒毛膜促性腺激素、芳香化酶抑制剂、枸橼酸他莫昔芬、克罗米芬或睾酮[10]。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与基线数据:受试者血液、精液标本均在早晨空腹采集,禁欲时间需在2～7 d。精液收集后需在1 h内进行检测。测量身高和体重后计算体重指数(BMI),BMI>25.00 kg/m2判定为异常。

1.2.2 精浆炎症活性标志物:使用弹性蛋白酶(Elastase)ELISA试剂盒(莱尔生物科技公司),根据供应商提供的试剂盒使用说明书操作,测定精液中性粒细胞活性标志物弹性蛋白酶,该试验的变异系数为2%,参考值为1.0～400 ng/ml,>290 ng/ml表明生殖泌尿系感染或炎症[11]。

1.2.3 肠道通透性标志物:使用人连蛋白(Zonulin)ELISA试剂盒(莱尔生物科技公司 中国安徽)测量血清中Zonulin的水平,>8.5 ng/ml判定为异常,本试验的批间变异系数为3%[12]。

1.2.4 内毒素:ELISA试剂盒(莱尔生物科技公司)测定血清使用脂多糖结合蛋白(LBP)水平。采用双抗体一步夹心法ELISA进行检测,通过LBP分析间接量化代谢性内毒素血症,>15.3 ng/ml判定为异常[13,14]。

1.2.5 精液氧化应激:使用8-羟基脱氧鸟苷(8OHdG)ELISA试剂盒(莱尔生物科技公司),采集后的精液经3 500 r/min离心10 min后取上清液,使用酶联免疫吸附法检测80HdG,参考值为2.0～800 ng/ml,>120 ng/ml判定为异常[15]。

1.2.6 精子形态学检测:经37℃恒温箱孵育液化后的精液涂片,自然干燥后使用WHO推荐的DIFF-QUICK快速染色试剂盒(博锐德生物有限公司 中国深圳)进行染色,采用全自动精子形态分析软件(穗加软件公司 中国北京)在光学显微镜1 000倍镜下计数>200条的精子,并计算精子的正常形态率,正常形态精子占比<4%判定为异常。所有操作由同一名人员进行检测,以确保数据的精准性。

1.2.7 激素测定:采用自动化学发光免疫分析法测定血清睾酮(TT)、促卵泡生产素(FSH)、促黄体生成素(LH)和雌二醇(E2),上述激素参考范围分别为1.93～8.36 ng/dl、0～70 pg/ml、1.5～12.4 mU/ml、1.7～8.6 mU/ml。

2 结果

2.1 2组年龄、体重指数比较 对全部684例观察对象进行分析,年龄23～52岁,观察组≥40岁人群占比15.2%(69/453),对照组≥40岁人群占比10.8%(25/231),2组间比较差异无统计学意义(χ2=0.065P=0.818);684例患者BMI为21.3～33.6 kg/m2,观察组BMI≥25 kg/m2人群占比72.4%(328/453),对照组BMI≥25 kg/m2人群占比25.1%(58/231),2组间差异有统计学意义(χ2=8.231,P=0.009)。见表1。

表1 2组年龄、BMI比较

2.2 2组血清Zonulin、LBP和8OHdG水平比较

2.2.1 684例患者肠通透性标志物血清Zonulin水平为2.3～21.42 ng/ml,观察组异常(Zonulin≥8.5 ng/ml)率为79.7%(406/453),对照组异常率为8.2%(19/231),2组间比较差异有统计学意义(χ2=9.635P=0.002)。见表2。

表2 2组血清BMI与LBP、Zonulin、8OHdG水平比较

2.2.2 684例患者代谢性内毒素血症标志物LBP水平为6.1～63.2 ng/ml,观察组异常(≥15.3 ng/ml)率为69.3%(314/453),对照组异常率为29.4%(68/231),2组间比较差异有统计学意义(χ2=7.524P=0.013)。见表2。

2.2.3 精浆氧化应激活性标志物:8OHdG为13.4～694ng/ml,观察组异常(≥120 ng/ml)率为73.5%(333/453),对照组异常率为19.9%(46/231),2组间比较差异有统计学意义(χ2=5.964P=0.018)。见表2。

2.3 2组性激素水平、感染性标志物比较 TT结果为1.08～7.3 ng/dl,观察组异常(<1.93 ng/dl或>8.36 ng/dl)率为4.6%(21/453),对照组异常率为2.2%(5/231),组间差异无统计学意义(χ2=0.065,P=0.657);FSH结果为0.8～18.4 mU/ml,观察组异常(<1.5 mU/ml或>12.4 mU/ml)率为4.9%(22/453),对照组异常率为1.3%(3/231),组间对比(χ2=0.034,P=0.601),异常率无差异性;LH结果为1.3～11.4 mU/ml,观察组异常(<1.7 mU/ml或>8.6 mU/ml)率为5.3%(24/453),对照组异常率为5.2%(12/231),组间差异无统计学意义(χ2=0.021,P=0.592); E2结果为12.4～103 pg/ml,观察组异常(≥70 pg/ml)率为43.5%(197/453),对照组异常率为10%(23.0/231),组间差异有统计学意义(χ2=6.954,P=0.019);弹性蛋白酶Elastase结果为14～423.3 ng/ml,观察组异常(≥290 ng/ml)率为14.8%(67/453),对照组异常率为16.9%(39/231),组间差异无统计学意义(χ2=0.026,P=0.648)。见表3。

表3 2组性激素水平比较

2.4 BMI与LBP、Zonulin、8OHdG的相关性 Zonulin和BMI呈正相关(r=0.647,P=0.000);LBP和BMI呈正相关(r=0.514,P=0.000);8OHdG与BMI呈正相关(r=0.562,P=0.000)。见表4。

表4 BMI与各变量间的相关性分析结果

2.5 TT与BMI无相关性(r=0.195,P=0.395);FSH与BMI无相关性(r=0.032,P=0.475);LH与BMI无相关性(r=0.066,P=0.441);E2与BMI存在正性相关(r=0.727,P=0.028);Elastase与BMI无相关性(r=0.046,P=0.717)。提示在观察组,仅有E2的异常率较高,且E2 与BMI存在正性相关关系。见表4。

2.6 多因素Logistic回归分析结果 BMI(OR=5.984,P=0.004)、8OhdG(OR=3.521,P=0.001)、Zonulin(OR=3.241,P=0.017)、LBP(OR=5.511,P=0.001)、E2(OR=4.671,P=0.026)是影响精子畸形率的高危因素。年龄、Elastase、TT、FSH、LH均不是影响精子畸形率的高危因素。见表5。

表5 影响精子畸形率的多因素Logistic回归分析表

3 讨论

肥胖是导致糖代谢紊乱、高脂血症、激素水平异常及血栓性疾病等多种与代谢异常相关疾病的高危因素[16]。除此之外,肥胖还会造成肠上皮细胞通透性增加,而肠管通透性增加与代谢性内毒素血症、全身炎症反应有关[17]。摄入过多含有脂肪的食品则会导致这种改变发生[11,18]。人连蛋白Zonulin是一种分子质量为47 kD的蛋白,产自于肠上皮和肝脏,它的作用是调节肠上皮细胞间的连接紧密程度,从而调节大分子、白细胞和液体在肠腔与血液之间的迁移,是公认的肠通透性标志物[19]。肥胖者体内过多的脂肪组织会产生大量的炎性细胞因子(如TNFα和IL-6),触发Zonulin释放增多,肠上皮通透性增高,肠道内细菌随之迁移进入循环系统,激活炎性反应[14,20,21]。细菌跨膜通常由以下两条途径实现,其一是Zonulin降低肠上皮细胞间的紧密连接,产生细胞间通道;其二是由胆汁酸微胶粒穿过肠上皮细胞膜脂多糖片段而形成的跨细胞通道[22,23]。肠腔内多见革兰氏阴性菌,在其细胞壁上含有大量强效免疫刺激物内毒素粘多糖(LPS),进入循环系统后,这些肠道来源的细菌会被免疫细胞所标识,并激活炎性反应[11,20,24,25]。此时,肝脏内另一种糖蛋白被激活,并大量产生,那就是血清脂多糖结合蛋白LBP,其分子量大小为55～60 kD,在正常状态下LBP浓度极低,当机体出现细菌感染所导致的炎性反应时,血清LBP迅速升高,并与LPS结合形成LPS-LBP复合物,反映内毒素血症的严重程度[26]。

内毒素血症引起炎症反应,炎性反应诱发氧化应激,促使白细胞产生大量的活性氧(ROS)。8OHdG是评价氧化应激严重程度的标记物,它是由鸟嘌呤碱基受到ROS攻击而生成的一种氧化加合物。精浆8OHdG的增高反映了睾丸组织受到了氧自由基攻击[27]。ROS是强氧化剂,会对侵入循环系统的细菌和正常人体组织发起无差别化攻击,其中就包括曲细精管、生精上皮、精子细胞和Leydig细胞,导致一定程度的激素分泌异常、生精功能障碍以及精子畸形率增加[28,29]。有学者将健康小鼠精子暴露于含有内毒素标志物LBP的培养液中进行观察,并指出即使是低剂量的内毒素实验性暴露,也会导致健康精子发生功能性损害[30]。

我们此次进行的研究,首先提示肥胖程度与肠上皮通透性呈现正性相关,肥胖越严重,肠道通透性越强。这将导致肠道细菌移位,迁移进入循环系统。其次,因为迁移进入循环系统的肠道细菌携带大量内毒素粘多糖,机体反应性的产生了大量的脂多糖结合蛋白,与内毒素粘多糖结合形成LPS-LBP复合物,刺激机体炎症反应发生。肥胖程度与LBP也呈现正性相关,提示肥胖越严重,代谢性内毒素血症越严重。另外,因炎症激活ROS释放,肥胖程度与精液中的氧化应激标志物8OHdG同样呈现出了正性相关关系,提示精液内出现ROS攻击精子细胞核后的产物,且肥胖越严重,精子受到的氧化攻击越严重。但此次研究并未发现睾酮水平与肥胖呈现出相关性,这与部分学者提出的肥胖可引起睾丸激素分泌异常的结论不相符。探索原因,这可能与本研究的被观察样本量相对较小有关,也可能是因为被观察对象氧化应激并未达到损伤睾丸内分泌功能的严重程度,但我们仍然认同他们的观点。另外,我们发现肥胖严重程度与雌二醇表达呈正性相关,肥胖程度越严重,雌二醇水平越高。考虑这可能与肥胖人群脂肪肝多发,雌激素灭活不足有关。而过多的雌激素可对抗睾酮生物活性,间接的影响睾丸功能与精子质量。

在进行了多因素Logistic回归分析后,我们发现肥胖、代谢性内毒素血症、氧化应激、肠道通透性、雌二醇是影响精子畸形率的高危因素,年龄、精浆感染性炎症、睾酮、促卵泡生成素、促黄体生成素不是影响精子畸形率的高危因素。即使在校正了相关混杂因素(例如吸烟,饮酒,禁欲时间)后,这种结论也未发生明显变化。

益生菌是改善肠上皮屏障功能,减少肠道细菌异位的有效药物[27]。有报道称,益生菌可以改善精子质量和提高睾丸激素水平[28]。我们推测这种改善可能与肠道细菌异位减少以及氧化应激减弱有关。在改善肥胖人群精子畸形率时推荐使用益生菌,联合抗氧自由基的食品、药品摄入(如:富含超氧化物歧化酶SOD的香蕉、山楂、刺梨、猕猴桃、大蒜以及维生素C、天然型维生素E、左卡尼汀等),可能成为有别于传统抗氧化剂治疗的潜在替代疗法。但效果如何,尚需后续研究进一步观察。

综上所述,肥胖可诱发代谢性内毒素血症,肠道通透性的增加以及内毒素水平的升高可造成全身炎症反应,诱导氧化应激的出现。由氧化应激造成白细胞释放的活性氧ROS将会造成精子畸形率升高。增强肠道屏障功能的新疗法可能会减少肥胖相关的炎症氧化应激,从而改善精子畸形率,改善妊娠结局。