可溶性α-烯醇化酶由CD14依赖性TLR4信号通路激活单核细胞并影响类风湿关节炎进展的机制

朱玉光 方丽佳 黄素玲

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性自身免疫性疾病,其特征是存在自身抗体、持续的滑膜炎和全身炎症[1-3],可导致关节破坏和残疾,患病率为0.5%～1%[4-6]。RA各种自身抗原已被证明是滑膜T细胞的靶标,并且自身抗体存在于患者的血清和滑液中[7-9]。在RA发展过程中已检测到几种自身抗体,例如RA患者的血清和滑液中的类风湿因子,具有良好的敏感性(75%～90%),但特异性较差(40%)[10-12]。高度特异性的自身抗体(98%)被称为抗瓜氨酸蛋白/肽自身抗体(ACPA)。瓜氨酸残基是通过肽基-精氨酸脱亚胺酶(PAD)催化的精氨酸的翻译后修饰产生的。这种修饰改变了蛋白质的抗原性。据报道,几种瓜氨酸化自身抗原,包括纤维蛋白原、波形蛋白和α-烯醇化酶(α-enolase,ENO1),是RA患者滑膜组织中ACPA的靶抗原[13,14]。ENO1是一种主要的自身抗原。早期RA患者的血清中发现了针对ENO1的自身抗体。ENO1是一种高度保守的糖酵解酶,是一种多功能蛋白,在细胞表面表达时也起到纤溶酶原受体的作用,这表明它可能在RA病理生理学中纤溶系统的调节中发挥重要作用[15-17]。CD14最初被表征为膜相关糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白和存在于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞上的细胞表面分化标志物,在其中它充当脂多糖(LPS)的受体。由于CD14缺乏跨膜结构域,无法自行启动信号反应。与CD14结合的LPS被转移到Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)-髓样分化因子2(MD-2)复合物,随后在其中传递细胞内信号。TLR4是Toll样受体家族的成员。其下游信号通路包括NF-κB和MAPKs。NF-κB是促炎基因表达的重要调节因子,如肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin,IL-6)、IL-8,并在在炎症调节中起关键作用。MAPK家族蛋白,包括哺乳动物中的细胞外信号调节激酶、c-Jun N末端激酶(JNK)和p38,与RA发病机制密切相关。JNK调节基质金属蛋白酶(MMP)的表达及滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭以及关节的破坏。P38对RA发病机制至关重要,因为它的激活涉及RA相关病理的几乎所有方面,包括促炎细胞因子的表达、滑膜炎、软骨退化、骨破坏和血管生成。本研究旨在探究可溶性ENO1通过CD14依赖性TLR4信号通路激活单核细胞并影响RA进展的机制。

1 材料与方法

1.1 实验小鼠 32只5～6周龄的雄性DBA/1小鼠购自江苏西山中科实验动物有限公司[动物合格证号SCXK(苏)2023-0001]。小鼠可以自由获取食物和水。所有动物护理程序遵循中国科学技术部《实验动物护理和使用指南》。本研究中使用的动物实验方案经实验动物管理与伦理委员会批准。

1.2 RA小鼠模型的建立 在第0天,将100 μl 牛Ⅱ型胶原(BⅡC)和弗氏完全佐剂(CFA)的乳液(含有100 μg BIIC)皮下注射到每只小鼠尾巴的基部,对照组除外。RA中度组和RA重度组在初次免疫后7 d进行BIIC和IFA乳液的加强注射。RA重度组在加强注射后7 d进行BIIC和IFA乳液的再次加强注射,21 d处死小鼠。

1.3 分组 适应实验室条件7 d后,将所有小鼠随机分为4组:对照组(标准条件下饲养的小鼠,皮下注射0.9%氯化钠溶液),RA轻度组(第0天皮下注射BIIC)、RA中度组(第0和7天皮下注射BIIC)和RA重度组(第0、7和14天皮下注射BII),每组8只。

1.4 方法

1.4.1 关节炎严重程度评估:使用已建立的每爪0～4分的宏观评分系统在第21天评估关节炎的严重程度。评分如下:0分,正常关节;1分,一个关节肿胀(脚趾/手腕/脚踝/小径);2分,不止一个关节肿胀;3分,所有关节肿胀;4分,皮肤破裂、功能障碍或关节变形。每只小鼠四只爪子的累积分数用作关节炎指数,以代表整体疾病严重程度和进展。

1.4.2 苏木精和伊红(HE)染色:滑膜组织的石蜡切片用H&E染色。右后肢标本用10%(V/V)中性甲醛溶液固定24 h,包埋在石蜡中,切成4 μm厚的组织切片。根据先前描述的方案进行HE染色。

1.4.3 酶联免疫吸附试验:在第21天,所有小鼠通过CO2窒息实施安乐死。立即采集血样,在室温下自然凝固1 h,4℃下以3 000×g离心10 min。用ELISA试剂盒测定上清液(血清)的ENO1、CD14和TLR4表达水平。在SPARK酶标仪(Tecan公司,瑞士)上测定450 nm波长处的吸光度。

1.4.4 定量实时 PCR:从小鼠滑膜组织制备总RNA并用作第一链cDNA合成的模板。使用QuantStudio 6系统(ABI公司,美国)进行定量实时 PCR 分析。反应混合物包含 10 μl SYBR Green Master Mix、0.4 μl ROX Reference Dye(50×)、1 μl cDNA、0.4 μl正向和反向引物(10 μmol/L)和 7.8 μl无 RNase 水。扩增方案如下:在 95℃下 10 min的初始变性步骤,40 个三步循环,包括变性步骤(95℃,15 s),退火步骤(60℃,60s),和一个延伸步骤 (72℃,15 s)。实验结果采用 2-ΔΔCt法计算。

1.4.5 蛋白质印迹:冷冻的滑膜组织在冰上含有 1 mmol/L 原钒酸钠和 1 mmol/L PMSF 的冷 RIPA解缓冲液中均质化。将匀浆在 4℃ 下以 13 000 × g 离心 10 min以去除碎片。上清液的总蛋白浓度用 BCA 法定量。通过 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质(40 μg)并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜用 5% (W/V) 脱脂奶粉在 Tris 缓冲盐水 Tween 20 (TBST,10 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,pH值7.4,0.5% Tween 20) 中封闭 1.5 h,与初级针对小鼠的抗体,包括GAPDH (1∶10 000)、ICAM-1(1∶2 000)、MCP-1 (1∶1 000)、CCL3 (1∶1 000)、NF-κB p-p65 (1∶800)、p-JNK (1∶1 000)和MAPK p-p38 (1∶1 000),在 4℃下过夜。用 TBST (3×10 min) 洗涤后,将膜与 HRP 标记的山羊抗小鼠或抗兔二抗 (1∶1 000) 在室温下孵育1.5 h。蛋白质条带根据制造商的说明用 ECL 检测试剂显色,并暴露于 X 射线胶片。使用 Image Lab 3.0 (Bio-Rad,Hercules,CA,美国) 分析抗体反应条带的强度水平。

1.4.6 细胞增殖试验:使用细胞增殖 ELISA(BrdU;Roche,Basel)测定增殖,并使用酶标仪(Bio-Rad,Hercules,CA)测量 450 nm 处的光密度。

2 结果

2.1 4组关节炎指数评分比较 通过关节炎指数评分系统在第 21天评估关节炎的严重程度,结果显示RA组关节炎指数评分较对照组升高(P<0.05),随RA进展增加,关节炎指数评分升高(P<0.05)。见表1,图1。

图1 不同处理组右后肢

表1 4组关节炎指数评分比较 n=8,分,

2.2 滑膜细胞增殖随RA进展激活 通过HE 染色检测滑膜组织,结果显示RA轻度组滑膜组织结构乎正常,RA中度组和RA重度组中观察到严重滑膜细胞增殖、增生的纤维组织和浸润的炎性细胞。见图2。

图2 滑膜细胞增殖(HE×100)

2.3 4组ENO1、CD14和TLR4水平比较 RA组ENO1、CD14和TLR4表达水平较对照组升高(P<0.05),随RA进展增加,ENO1、CD14和TLR4表达水平升高(P<0.05)。见表2。

表2 ELISA分析ENO1、CD14和TLR4表达水平n=8,μg/ml,

2.4 4组TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表达水平随RA进展增加 RA组TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表达水平较对照组升高(P<0.05),随RA进展增加,TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表达水平升高(P<0.05)。见表3。

表3 4组TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表达水平比较n=8,

2.5 4组ICAM-1、MCP-1和CCL3蛋白质表达表达水平比较 RA组ICAM-1、MCP-1和CCL3蛋白质表达水平较对照组升高(P<0.05),随RA进展增加,ICAM-1、MCP-1和CCL3蛋白质表达水平升高(P<0.05)。见图3,表4。

图3 蛋白印迹分析ICAM-1、MCP-1和CCL3表达

表4 4组ICAM-1、MCP-1和CCL3表达比较n=8,

2.6 4组单核细胞增殖速率比较 通过ELISA分析单核细胞增殖速率,结果显示RA组单核细胞增殖速率较对照组升高(P<0.05),随RA进展增加,单核细胞增殖速率升高(P<0.05)。见表5。

表5 4组细胞增殖速率比较 n=8,

2.7 NF-κB p-p65、p-JNK和MAPK p-p38蛋白质表达表达水平随RA进展增加 RA组NF-κB p-p65、p-JNK和MAPK p-p38蛋白质表达水平较对照组升高(P<0.05),随RA进展增加,NF-κB p-p65、p-JNK和MAPK p-p38蛋白质表达水平升高(P<0.05)。见表6。

表6 4组NF-κB p-p65、p-JNK和MAPK p-p38表达水平比较 n=8,

3 讨论

RA被认为是一种多因素自身免疫性疾病。其发病机制涉及表观遗传改变、翻译后修饰、自噬、T细胞和其他因素[18-21]。

众所周知,炎性反应涉及许多促炎介质,参与了RA发病机制的每个阶段[22-24]。已有研究发现,早期未治疗的RA中的自身抗体库针对几种抗原,特别是ENO1[25-27]。针对天然ENO1的自身抗体存在于早期RA7患者的血清中,但也存在于多种传染病和自身免疫性疾病中。虽然自身抗体对瓜氨酸化ENO1的作用在RA中得到了更好的理解,但识别ENO1天然形式的自身抗体的作用仍不清楚。迄今为止,笔者未发现有研究调查ENO1在免疫系统细胞中的潜在影响。在本研究中,发现ENO1诱导促炎细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-8的早期产生。细胞计数分析表明ENO1主要与单核细胞结合。此后,单核细胞能够响应ENO1产生一组促炎细胞因子,如TNF-α、IL-6和IL-8。这些细胞因子在RA病理生理学中具有关键作用,包括炎症的持续存在。ENO1刺激的单核细胞还产生多种趋化因子,如ICAM-1、MCP-1和CCL3,它们参与急性炎症状态、白细胞的募集和激活。

已有研究表明,ENO1在造血细胞中的上调表面表达在炎症过程中起重要作用,因为ENO1在人类单核细胞上的细胞表面表达通过ENO1快速转运到细胞表面而迅速上调[28-30]。ENO1的细胞表面表达增加了从RA患者中分离出的单核细胞和巨噬细胞的数量,并且针对ENO1的抗体可以刺激这些细胞产生更多的促炎介质,例如TNF-α、IL-1α/β和IFN-γ。可溶性CD14由HepG2肝癌细胞和外周血单核细胞在IL-6刺激下产生,这表明可能存在正反馈回路,其中CD14引起RA成纤维细胞样滑膜细胞炎症,而IL-6由活化的RA成纤维细胞样滑膜细胞产生。FLS促进肝细胞和单核细胞进一步产生CD14。分子分析表明,滑膜巨噬细胞中mCD14的蛋白水解切割对CD14的产生很重要。RA的最佳治疗仍有许多未满足的需求。改善疾病的生物抗风湿药物,如抗TNF-α抗体,在临床实践中已显示出相当大的疗效,但许多患者仍存在活动性疾病。TLR4抑制剂治疗RA被认为是另一种有希望的候选药物,一些TLR4抑制剂已在体外和体内显示出一些治疗效果。一种抗TLR4单克隆抗体现已进入II期临床试验。进一步了解RA发病机制中的内源性TLR4配体对于适当和有效地使用这些新治疗剂至关重要。在TNF-α抑制剂治疗后,RA患者的血清中存在相对较高浓度的CD14(约1 900 ng/ml)。因此,TLR4抑制剂治疗可以提供一种新的补充治疗,特别是在对TNF-α抑制剂反应不足和SF或血清中高水平CD14的RA患者中。我们发现ENO1诱导CD14和TLR4的激活。

NF-κB/MAPK通路是RA治疗的一个合理的治疗靶点。ENO1依赖性激活NF-κB p65、JNK和p38 MAPK磷酸化水平,表明ENO1可能增加血管生成、软骨退化和骨破坏,因为JNK和p38的激活涉及这些RA相关的病理。

综上所述,本研究表明,可溶性ENO1通过CD14依赖性TLR4信号通路,诱导促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8的早期产生,激活NF-κB/MAPK信号通路,促进单核细胞和滑膜细胞增殖,从而影响RA进展。本研究结果可能为一种涉及阻断RA中ENO1/CD14/TLR4信号通路的新治疗策略指明了方向。