克立硼罗软膏调节角质形成细胞异常活化缓解小鼠银屑病作用

桂雨晴,唐彩红,陈镜宇,姜 玲,2,魏 伟

克立硼罗(crisaborole,Cri)是磷酸二酯酶4(phosphodiesterases 4,PDE4)抑制剂,通过抑制PDE4活性,增加细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的含量,发挥抗炎免疫作用。Cri软膏能显著减轻特应性皮炎的瘙痒反应,用于治疗3个月以上儿童和成人的轻度或中度特应性皮炎[1],也有报道[2]Cri对银屑病有效,但机制不清楚。银屑病是一种慢性炎症增殖性皮肤病变,角质形成细胞的异常增殖分化是其重要特点。角质形成细胞的异常分化引起银屑病斑块脱落,同时参与皮损区T细胞活化,起着放大皮损区免疫异常作用[3]。体外研究[4]表明Cri体外可以降低人表皮角质形成细胞促炎介质肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1α 和趋化因子8的表达,提示角质形成细胞可能是Cri的靶细胞,而Cri软膏是否通过调节角质形成细胞功能发挥对银屑病的治疗作用仍不清楚。该研究利用银屑病小鼠模型,从角质形成细胞的角度探讨Cri治疗银屑病的作用机制,为开发Cri新的适应证提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物Balb/c小鼠,48只,雌性,7～8周龄,购于北京斯贝福生物科技有限公司[生产许可证:SCXK(京)2019-0010],饲养在安徽医科大学临床药理研究所的SPF动物研究室。所进行的动物实验,都经过安徽医科大学临床药理研究所动物实验伦理委员会认可(动物伦理批号:PZ-2022-001)。本实验中所涉及的技术,都遵循动物实验的有关准则和规范。

1.2 药物与试剂角蛋白(keratin,K)1一抗、K10一抗(美国Proteintech公司,批号:00045116、14t1484);K6一抗、K16一抗、GAPDH一抗(英国Affinity公司,批号:00059940、39d4400、62u0922);K17一抗、磷酸化-cAMP反应元件结合蛋白(phospho-cAMP response element binding protein,p-CREB)一抗(美国Cell Signaling公司,批号:4543T、9189S);ECL化学发光试剂(美国赛默飞公司,批号:TG269475);EDTA 抗原修复液(pH 9.0)、免疫组化通用型试剂盒(北京中杉金桥公司,批号:19042401、2010D1217);咪喹莫特(imiquimod,IMQ)乳膏(四川明欣药业有限责任公司,批号:19070240);Cri软膏(美国辉瑞公司,批号:8119272);卤米松(香港澳美制药公司,批号:0101390227);凡士林乳膏(天津市博迪化工有限公司,批号:11021);脱毛膏(植物医生温和套装,北京明弘科贸有限责任公司,批号:ACG0800604)。

1.3 仪器酶标仪(型号:Infinite M1000 PRO,瑞士TECAN公司);正置荧光显微镜(型号:DM2500,德国Leica公司);化学发光成像系统(型号:ImageQuant,美国GE公司)。

1.4 动物分组与银屑病模型的建立将48只Balb/c小鼠随机分成模型组、正常组、Cri(7.5、15、30 mg/cm2)组(Cri低、中、高剂量组)、卤米松(15 mg/cm2)组,每组8只,造模前3 d每只背部脱毛(2 cm × 3 cm)2 min,为防止背部毛发再生影响后续造模及评分,造模前1 d进行第2次背部脱毛。造模后第1～3天,正常组涂抹凡士林以外,其余各组背部皮肤涂抹62.5 mg IMQ(5%)乳膏每天1次,第4天开始各给药组先涂抹62.5 mg IMQ(5%)乳膏1次,待其吸收后,Cri组涂抹相应的Cri剂量(45、90、180 mg)1次,卤米松组涂抹卤米松(90 mg)1次,连续涂抹药物4 d,第8天处死小鼠。

1.5 小鼠背部皮肤观察造模后第1、3、5、7天对小鼠拍照观察并且根据银屑病面积和严重程度指数(psoriasis area and severity index,PASI)对小鼠皮损处的厚度、红斑状况、银屑状况进行评分。PASI评分标准为:0～4分,分别对应皮损程度无、轻度、中等、严重和极重度;总分为厚度、红斑、鳞屑3项评分之和(0～12分),得分越高,皮损越严重[5]。

1.6 小鼠皮肤组织病理学观察第8天处死小鼠当天,去小鼠背部皮损处皮肤,小鼠背部1/4的皮肤用4%多聚甲醛固定,其余组织放在-80 ℃保存。2周后石蜡切片、HE染色,在显微镜下观看和拍照,随机对每个切片选取3个位置,测其角质层到基底层的垂直距离,并对其进行统计分析。

1.7 免疫组化检测小鼠皮肤中增殖及分化蛋白的表达将动物皮肤进行石蜡包埋法后切片,烤片2 h ,梯度脱蜡,PBS清洗,再加EDTA抗原结合修复液20 min后,用PBS清洗,再加入内源性过氧化物酶抑制剂15 min,然后滴加一抗(K1、K10、K6、K16、K17)4 ℃过夜,第2天取出,室温放30 min,PBS清洗,二抗孵育,DAB显色,用苏木精复染,梯度脱水,中性树脂封片,在显微镜下观察。

1.8 ELISA检测小鼠皮肤中蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、cAMP的表达ELISA试剂盒检测小鼠背部皮损处皮肤中PKA、cAMP的表达,首先搅拌试剂使均匀,以防止形成气泡而造成误差,在各个标准品和待测样品孔都设置2个复孔,再确定所需要的孔数。加检测抗体孵育,洗板,加酶孵育,洗板后,加着色剂显色反应,取出酶标板,再加终止液使化学反应完全停止,并立即在450 nm波长处测量各孔的吸光度值;绘制标准曲线,并算出PKA、cAMP的水平。

1.9 Western blot检测小鼠皮肤中p-CREB水平蛋白的表达配制裂解溶液,RIPA ∶PMSF ∶磷酸酶抑制剂=98 ∶1 ∶1,裂解液4 ℃裂解2 h,离心后,取其上清液;加入上样缓冲液煮沸。电泳,转膜,5%脱脂牛奶封闭2 h,洗膜后加入p-CREB抗体孵育4 ℃ 过夜;第2天洗膜后二抗孵育2 h,洗膜、显影,并分析灰度值。

2 结果

2.1 小鼠皮肤形态学观察正常组小鼠皮肤光洁平整。模型组小鼠第1天开始就出现轻度鳞屑和增厚;第3天出现明显的鳞屑和增厚症状;第5天鳞屑明显增加并覆盖大面积皮肤,增厚症状更加突出,红斑也增加;第7天鳞屑几乎遍布整个背部皮肤,表皮厚度也大大增加,出现明显的红斑。 Cri各剂量组和卤米松组的小鼠前几天皮损加重,但从第5天开始皮损处开始改善。见图1。

2.2 Cri对小鼠皮肤PASI评分影响从第1天开始每天对实验小鼠背部拍照观察,按照PASI的评分标准进行评分。模型组小鼠从第2天开始有鳞屑、红斑、增厚的情况。模型组小鼠增厚评分在7 d内持续升高,见图2A;与模型组相比,Cri低剂量(F=10.17,P<0.05)组、Cri中剂量组(F=10.17,P<0.01)、高剂量组(F=10.17,P<0.01)和卤米松组(F=10.17,P<0.01)增厚评分降低,差异有统计学意义。模型组小鼠鳞屑评分在6 d内不断增加,见图2B;与模型组相比,Cri中剂量组(F=4.43,P<0.01)、高剂量组(F=4.43,P<0.01)和卤米松组(F=4.43,P<0.05)鳞屑评分降低,差异有统计学意义。模型组小鼠红斑评分在6 d内不断增加,见图2C;与模型组相比,Cri低剂量(F=4.63,P<0.01)组、Cri中剂量组(F=4.63,P<0.01)、高剂量组(F=4.63,P<0.01)和卤米松组(F=4.63,P<0.01)红斑评分降低,差异有统计学意义。将各项评分相加后得到总分,总分在6 d内不断增加,见图2D;与模型组相比,Cri中剂量组(F=6.44,P<0.01)和高剂量组(F=6.44,P<0.01)总分降低,PASI评分差异有统计学意义;Cri各剂量组和卤米松组间PASI评分差异无统计学意义。以上结果表明,Cri低、中、高剂量组和卤米松组可以不同程度地改善小鼠皮肤的红斑、鳞屑、增厚情况。

图2 Cri对IMQ诱导的小鼠PASI评分的影响(n=8)

2.3 Cri对小鼠皮肤组织病理学和表皮厚度的影响HE染色后观察小鼠皮肤病理改变,相较于正常组,模型组小鼠表皮明显增厚、血管增生和炎症细胞浸润,角化不全或角化过度,颗粒层变薄,棘层肥厚以及棘层不规则延长。上述病理变化在各给药组有不同程度改善。对病理切片随机选取的3处角质层到基底层的垂直距离进行测量,取其平均值用Image J软件进行统计学分析。与正常组相比,模型组表皮厚度明显增厚,差异有统计学意义(F=57.78,P<0.01)。与模型组相比,Cri低剂量组(F=18.64,P<0.05)、中剂量组(F=18.64,P<0.01)、高剂量组(F=18.64,P<0.01)及卤米松组(F=18.64,P<0.01)表皮厚度明显减小,差异有统计学意义;与Cri低剂量组相比,Cri中剂量组(F=4.996,P<0.05)、高剂量组(F=4.996,P<0.05)及卤米松组(F=4.996,P<0.05)表皮厚度明显减小,差异有统计学意义;与卤米松组相比,Cri中、高剂量组表皮厚度差异无统计学意义。见图3。

2.4 Cri对小鼠皮肤组织中角质形成细胞增殖蛋白表达的影响免疫组化结果表明模型组小鼠在皮损部位的皮肤组织中K6、K16、K17蛋白表达水平高于正常组,差异有统计学意义(F=12.62、19.41、28.39,P<0.01)。与模型组比较,Cri高剂量组和卤米松组K6蛋白表达降低,差异有统计学意义(F=12.62,P<0.01);Cri中、高剂量组和卤米松组K16蛋白表达降低,差异有统计学意义(F=19.41,P<0.01);Cri中、高剂量组和卤米松组K17蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(F=28.39,P<0.01)。Cri各剂量组与卤米松组比较,K6、K16、K17的表达差异无统计学意义。以上结果提示模型组小鼠皮损处皮肤中角质形成细胞出现了过度增殖,Cri、卤米松可以缓解角质形成细胞过度增殖。见图4。

图4 Cri对IMQ诱导的小鼠皮肤组织K6、K16、K17中表达的影响(n=3)

2.5 Cri对小鼠皮肤组织中角质形成细胞分化蛋白表达的影响模型组中K10、K1的表达水平明显低于正常组,差异存在统计学意义(F=27.95、9.64,P<0.01),提示模型组小鼠皮损处皮肤中角质形成细胞出现了低分化。与模型组相比,Cri中、高剂量组及卤米松组K10的表达增加,Cri高剂量组及卤米松组K1的表达增加,提示中、高剂量的Cri以及卤米松可以促进角质形成细胞分化。Cri各剂量组与卤米松组比较,K10、K1的表达差异无统计学意义。见图5。

图5 Cri对IMQ诱导的小鼠皮肤组织K10、K1、中表达的影响(n=3)

2.6 Cri对IMQ诱导的银屑病小鼠皮肤中cAMP-PKA-pCREB信号的影响与正常组相比,模型组小鼠皮肤中cAMP、PKA、pCREB水平下降,差异有统计学意义(FcAMP=41.89,P<0.01;FPKA=7.46,P<0.05;FpCREB=7.52,P<0.05)。与模型组相比,Cri组cAMP、PKA、pCREB水平升高,差异有统计学意义(FcAMP=48.94,P<0.01;FPKA=12.20,P<0.05;FpCREB=18.13,P<0.05);与模型组相比,卤米松组cAMP、PKA水平升高,差异有统计学意义(FcAMP=48.94,P<0.01;FPKA=12.20,P<0.05)。提示Cri缓解小鼠银屑病的作用与促进cAMP-PKA-pCREB 信号通路有关,见图6。

图6 Cri对IMQ诱导的小鼠皮肤组织中cAMP-PKA-CREB通路表达的影响(n=3)

3 讨论

cAMP是调节多种细胞功能的第二信使,通过调节下游的信号分子,调节机体的炎症免疫反应[6]。PDE4通过上调cAMP的水平,减少炎症介质的生成,从而抑制银屑病的发生、发展[7]。以PDE4作为靶点的PDE4抑制剂已经被开发用于治疗银屑病等慢性炎性疾病[[8]]。目前已经获准用于银屑病治疗的PDE4抑制剂有口服阿普斯特,能够明显缓解银屑病和银屑病性关节炎的临床表现,但有腹泻、恶心等不良反应。外用PDE4抑制剂可以大大减少胃肠道不适的不良反应,外用Cri软膏已经获批用于治疗特应性皮炎。有临床研究[2]报道Cri软膏对银屑病有效,但作用机制不清楚。IMQ是一种Toll 样受体和有效的免疫激活剂,小鼠皮肤上局部连续涂抹 IMQ可诱导小鼠银屑病样皮炎,模拟人银屑病的发病和全身炎症。IMQ诱导的小鼠银屑病模型是公认的银屑病动物模型,广泛用于银屑病的病理机制和药物药效学研究[9]。本研究利用银屑病小鼠模型,探讨Cri治疗银屑病的作用,结果发现Cri可以降低IMQ诱导银屑病小鼠PASI 评分,改善皮肤鳞屑、增厚、红斑、角化不全、角化过度、炎性浸润等皮肤病理状况,提示Cri对 IMQ 诱导的小鼠银屑病有治疗作用。

银屑病的临床特征为角质形成细胞异常增殖和分化。角质形成细胞先天性免疫反应失调可能导致炎症失控和银屑病的发生[10]。体外研究发现Cri体外可以降低人表皮角质形成细胞促炎因子TNFα、IL-1α 和 CXCL8的表达[4],提示角质形成细胞可能是Cri作用的靶细胞。角蛋白是角质形成细胞中的主要结构中间丝蛋白,在角质形成细胞的不同分化阶段以高度特异性模式表达,维持角质形成细胞的结构稳定性和完整性。角蛋白已被广泛用作各种上皮细胞增殖或分化阶段以及表皮疾病诊断的标志蛋白,K10、K1是标记角质形成细胞分化的重要标记蛋白,K6、K16、K17的表达代表了病理条件下角质形成细胞的高度活化和增殖。角蛋白表达的变化可能引起表皮角质形成细胞的不完全分化,导致皮肤过度增生等[11]。本实验结果表明,与正常组比较,模型组中表皮的K1、K10表达明显降低,K6、K16、K17表达明显升高,而Cri给药后,K1、K10 表达明显增强,K6、K16、K17表达则明显降低;提示Cri能够抑制角质形成细胞异常增殖,促使其正常分化,这或许与其改善IMQ引起的银屑病小鼠的皮肤损伤的作用密切有关。

在炎症免疫信号影响下,G蛋白偶联受体通过Gαs活化腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC),形成cAMP,并活化cAMP-PKA信号[12]。PKA活化引起 CREB的磷酸化,从而启动基因的表达[13]。CREB活化后还能够与NF-κB竞争性结合CBP、p300控制NF-κB的转录,从而降低NF-κB相关促炎因子基因的表达水平[14]。角质形成细胞的分化和角蛋白的表达受到cAMP-PKA-CREB信号的调节[15]。有研究表明牛蒡子苷元可以与PDE4D的催化结构域结合,通过抑制PDE4导致细胞内cAMP升高和CREB磷酸化,调节角蛋白的表达。Cri是PDE4的抑制剂,通过抑制PDE4活性,增加细胞内cAMP的含量,发挥抗炎免疫调节作用。本研究结果表明Cri能提高cAMP、PKA水平升高,促进CREB的磷酸化,提示Cri治疗IMQ诱导的小鼠银屑病可能与激活cAMP-PKA-CREB通路有关。