血清外泌体miR-30d-5p靶向RHOB在三氯乙烯药疹样皮炎中的作用

蔡曙阳,王 慧,张雪松,左绪磊,马金茹,洪依婷,吴奇峰,朱启星,

三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)是一种工业上常用的有机溶剂,在TCE接触的职业工人中,少部分可出现类似于药疹样皮炎的皮肤大面积表皮坏死和剥脱,临床上称为三氯乙烯药疹样皮炎(occupational dermatitis medicamentosa-like of trichloroethylene,OMDT)[1]。除了皮肤损伤外,部分OMDT患者还伴有严重的肝功能异常,因此,开展TCE引起的肝脏损伤及其机制研究,具有重大的职业卫生意义。

目前,OMDT通常被认为是一种由T淋巴细胞介导的Ⅳ型变态反应为主的复合免疫反应[2],早些研究发现多种免疫细胞可以分泌外泌体,如巨噬细胞[3]、树突状细胞[4]和NK细胞[5],这些外泌体广泛存在于血液、尿液和唾液等体液中[6],参与免疫细胞间的通信作用。外泌体中miR-30d-5p被发现参与多种免疫反应,如非分型流感嗜血杆菌引起的急性中耳炎[7]、布氏弧杆菌引起的胃肠炎[8]等 ,但是在TCE引起的免疫性肝脏损伤中miR-30d-5p是否发挥作用还尚不明确。因此,该研究旨在探索OMDT患者肝脏损伤机制中miR-30d-5p的作用及可能参与的生物信息学过程。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取2020年广东省职业病防治院收治的OMDT患者6例,所有病例均按照 GBZ 185—2006《职业性三氯乙烯药疹样皮炎诊断标准》进行诊断[9]。纳入标准:① 有明确的TCE接触史;② 出现以皮疹、发热、肝功能损害和浅表淋巴结肿大等临床表现;③ 既往身体健康,无药物、食物过敏史。排除标准:① 有激素用药史或肝毒性药物使用史;② 有肝病家族史;③ 发病前接触其他明确的职业危害因素。另在安徽医科大学校医院收集肝功能正常的健康志愿者6例,与患者按照年龄(±3岁)和性别1 ∶1匹配。患者肝功能指标结果由住院病历中的检测报告单获得。本研究经安徽医科大学第一附属医院临床医学研究伦理委员会审核批准(批准号:5101302),所有患者均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂血清外泌体提取试剂盒、miRNA提取试剂盒(德国Qiagen公司);miRNA反转录试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司];Mix溶液(瑞士Roche公司);HSP-70抗体、Flotillin-1抗体、CD9抗体(英国Abcam公司);RIPA裂解缓冲液、PMSF蛋白酶抑制剂(上海碧云天生物技术有限公司);PVDF膜、Western blot发光液试剂盒(德国GE Healthcare公司);miR-30d-5p mimics、miR-NC mimics、野生和突变RHOB质粒、转染试剂(上海吉玛制药技术有限公司);HEK-293T细胞由安徽医科大学基础医学院赠予;DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素(美国Gibico公司)。聚合酶链式反应PCR仪(瑞士Roche公司,Light Cycler 96);纳米颗粒跟踪分析仪(德国Particle Metrix公司,PMX-120);透射电子显微镜(美国Thermo Scientific公司,Ta1os L120C G2);Western blot全自动化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司,Chemiscope 6000 Touch);微孔板发光检测仪 (美国Promega公司,GloMax96)。

1.3 血清收集与外泌体提取用含有促凝剂的采血管收集新鲜全血,室温静置5 min后以3 000 r/min离心15 min,将上层血清分装置于-80 ℃冰箱保存。取2 ml血清样本,按照血清外泌体提取试剂盒说明书进行操作,首先将溶解后的血清用0.22 μm过滤器过滤,与缓冲液XBP等体积混合,2 000 r/min离心1 min,之后加入3.5 ml的缓冲液XWP,12 000 r/min离心5 min,最后加入400 μl的缓冲液XE,2 000 r/min离心5 min,用PBS溶液重悬收集外泌体。

1.4 外泌体鉴定

1.4.1透射电子显微镜观察 将收集的外泌体用200 μl的PBS溶液重悬后滴至洁净封口膜上,然后用镊子夹取一枚载网置于外泌体液滴上,悬浮10 min,用滤纸缓慢吸干;后转移载网到2.5%戊二醛液滴上,悬浮5 min,用滤纸吸干;最后将载网转移到去离子水液滴上漂洗10次,每次2 min,漂洗完毕后用滤纸吸干,转移载网到40 g/L乙酸双氧铀液滴上染色10 min,滤纸吸干后转移载网到10 g/L甲基纤维素液滴上染色5 min,滤纸吸干液体后室温静置干燥10 min,放入样品架电镜下观察记录。

1.4.2纳米颗粒跟踪分析 首先用去离子水清洗机器样本池,然后以聚苯乙烯微球(100 nm)标准品对机器进行校准,再使用1×PBS溶液清洗机器样本池。准备工作完成后将外泌体样本用PBS溶液稀释至1×106/ml,用注射器注入纳米颗粒跟踪分析仪,每个样本重复测量3次,软件会对样本里颗粒的运动特征进行记录,同时加以分析后会得到粒径-浓度分布图数据,可以检测外泌体样品的粒径大小。

1.4.3Western blot法检测外泌体标志蛋白 提取外泌体样品蛋白并定量,然后使用SDS-PAGE进行电泳分离,200 mA转膜3 h,将PVDF膜在5%脱脂牛奶中室温封闭2 h。之后将膜与HSP-70(1 ∶1 000)、Flotillin-1(1 ∶1 000)、CD9(1 ∶1 000)抗体一起置于4 ℃孵育过夜。第2天,将膜在含有0.05% Tween-20的TBST中洗涤3次,每次10 min,然后与山羊抗兔IgG抗体或山羊抗鼠IgG抗体(1 ∶5 000)一起室温孵育2 h。将膜在含有0.05% Tween-20的TBST中洗涤3次,每次10 min,用ECL检测试剂盒进行显影。

试验数据采用SAS 9.0软件的统计程序进行T检验分析，统计结果P＜0.01表示组间差异极显著，P＜0.05表示组间差异显著，0.05≤P＜0.10表示组间差异趋于显著。

1.5 外泌体RNA提取与qRT-PCR检测使用外泌体RNA纯化试剂盒提取血清外泌体中包含miRNA的总RNA,采用加尾法逆转录为cDNA。于PCR仪中进行扩增,扩增条件:95 ℃预变性5 min后以95 ℃ 15 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循环45次。所得结果使用比较循环阈值(2-ΔΔCt)法分析,以miR-16作为内参基因,计算miR-30d-5p的相对表达量,每个样本重复检测3次。引物序列:miR-16(F):GC-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG;miR-30d-5p(F):TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG;通用引物(R):CGAGGTATTCGCACTGGATACGAC。

1.6 细胞培养与双荧光素酶报告基因实验验证将HEK-293T细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于37 ℃、5% CO2的培养箱中常规培养。使用购买的RHOB质粒与miR-30d-5p(miR-NC)模拟物进行实验。取对数生长期的HEK-293T细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板上,根据说明书进行操作,分别将配套的转染试剂与miR-NC模拟物、miR-30d-5p模拟物、野生型RHOB质粒、突变型RHOB质粒等共同加入细胞,随机分为4组:野生型+miR-30d-5p组(共转染野生型质粒和miR-30d-5p模拟物)、野生型+miR-NC组(共转染野生型质粒和miR-NC模拟物)、突变型+miR-30d-5p组(共转染突变型质粒和miR-30d-5p模拟物)、突变型+miR-NC组(共转染突变型质粒和miR-NC模拟物),6 h后弃去换成新的培养基,再过12 h左右完成转染过程,此时检测各组中萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性。

1.7 生物信息学分析采用功能聚类(gene ontology,GO)数据库对基因产物的属性进行分析,它包含三大类:生物学过程(biological process,BP);细胞组分(cellular component,CC);分子功能(molecular function,MF)。在Gene Ontology中输入miR-30d-5p,并选择物种为人类,检索后得到富集结果。途径富集(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)是分析基因功能、联系基因组信息和功能信息的数据库。在本研究中,使用KEGG数据库中的代谢通路数据库进行检索分析,探索miR-30d-5p的靶基因可能与哪些通路相关。

2 结果

2.1 研究对象基本情况12例研究对象均无激素用药史或肝毒性药物使用史,无肝病家族史,6例OMDT患者中男性4例(66.7%),女性2例(33.3%),均有明确的TCE接触史,与6例健康志愿者按性别和年龄与患者1 ∶1进行配对。以M(P25,P75)计,可知:OMDT患者年龄为20.0(17.5～23.8)岁;健康志愿者年龄为23(19.8～24.5)岁,经秩和检验两组年龄差异无统计学意义(Z=0.194,P>0.05)。

2.2 血清外泌体的鉴定电镜观察外泌体呈圆形、椭圆形,具有双层脂质包膜结构,Western blot法检测发现外泌体特征性膜蛋白CD9、Flotollin-1和HSP70表达阳性,纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径约200 nm,均符合外泌体的特征,见图1。

图1 血清外泌体鉴定

2.3 血清外泌体中miR-30d-5p基因表达水平的改变qRT-PCR结果显示,对照组、发病高峰期组和发病恢复期组血清外泌体中miR-30d-5p相对表达水平分别为:0.90(0.58,2.12),0.14(0.01,0.55),0.93(0.73,1.29)。发病高峰期组血清外泌体中miR-30d-5p表达水平明显低于其他两组,差异有统计学意义(H=6.398,P=0.034),见图2。

图2 患者各组血清外泌体miR-30d-5p表达水平

2.4 OMDT患者治疗前后肝功能指标水平的改变肝功能检查结果显示,6例患者入院时发病高峰期天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST) 、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT) 、γ-谷氨酰胺基转移酶(γ-glutamyl transferase,GGT)明显升高,与出院时发病恢复期比较差异有统计学意义(Z=-2.201,P=0.028;Z=-2.201,P=0.028;Z=-2.201,P=0.028),见图3。

图3 OMDT患者肝功能指标水平

表1 OMDT患者血清外泌体miR-30d-5p表达水平与肝功能指标的相关性分析

2.6 OMDT患者血清miR-30d-5p表达水平的生物信息学分析在miRWalk数据库中筛选出了535个miR-30d-5p的候选靶基因,在miRBD数据库中筛选出了736个miR-30d-5p的候选靶基因,两个数据库的交集显示了46个候选靶基因,采用GO分析和KEGG分析对这些候选靶基因结果进行进一步研究。GO分析从生物学过程、细胞组分和分子功能三个方面对结果进行描述,发现miR-30d-5p主要参与钙调素结合与钙调蛋白依赖性蛋白激酶的激活等73个分子功能,异三聚体G蛋白与转运囊泡膜等81个细胞组分以及血管形态学重构与肽基丝氨酸磷酸化等172个生物学过程,图4中展示的是相关性较为密切的前10个结果。KEGG分析表明大多数候选靶基因在胆碱能突触、破骨细胞分化、Apelin信号通路、Wnt信号通路和Oxytocin信号通路等途径中富集,图4中展示的是相关性较为密切显著的前30个条目。上述结果说明miR-30d-5p广泛参与机体免疫反应的生理病理学过程。

图4 功能聚类分析和生物通路分析

2.7 miR-30d-5p靶向调控RHOB基因为进一步明确miR-30-5p发挥生物学功能的可能机制,在上述生信分析结果中选取RHOB基因进行下一步研究。利用psiCHECK2质粒作为骨架,将预测的miR-30d-5p与RHOB结合部位序列及其突变体序列剪切并插入到萤火虫荧光素酶基因下游,分别构建野生和突变的RHOB表达载体,与miR-30d-5p模拟物或miR-NC模拟物同时转染入293T细胞进行双荧光素酶活性检测实验。结果显示:转染miR-30d-5p模拟物可显著下调带有RHOB野生3′-UTR序列的报告基因荧光素酶活性,而靶基因序列突变后的荧光素酶活性不受影响,转染miR-NC模拟物后不影响野生和突变组的报告基因荧光素酶活性,差异有统计学意义(F=11.458,P=0.003),见图5。以上结果证明miR-30d-5p模拟物可特异性靶向结合RHOB的3′-UTR序列,从而调控RHOB的表达水平。预测结合位点序列:RHOB 3′UTR:...AUGGUGAGCUUAUGAUGUUUACA...;miR-30d-5p 3′UTR:GAAGGUCAGCCCCUACAAAUGU。

图5 双荧光素酶报告基因

3 讨论

职业人群暴露TCE主要通过呼吸道和皮肤进入机体发挥毒性作用,影响多种脏器,其中以肝脏最为多见,可继发肝炎等多种疾病,严重影响患者预后。本研究6例患者在发病高峰期肝功能指标异常升高,存在明显的肝脏损伤。目前OMDT的肝损伤发病机制并未完全阐明,有待进一步研究。

一项研究[10]显示TCE暴露工人的外周血血清miR-150-5p等miRNA分子表达水平有明显改变,另一项研究[11]显示血清外泌体miR-21-5p和miR-339-5p表达水平与职业性三氯乙烯超敏反应综合征相关,外泌体miR-21和miR-690也被发现加重了TCE介导的免疫炎症反应[12]。因此,血清外泌体包裹的miRNA作为一种稳定的功能分子,无论是作为临床治疗的靶点,还是作为早期预测或诊断的生物标志物,在OMDT的临床研究中都具有广阔的前景。先前的研究[13]表明,miR-30d-5p可以通过参与T细胞与B细胞的激活调控机体的免疫反应,并且与非酒精性脂肪性肝等多种肝脏疾病的发生发展有关,结合一项关于TCE暴露人群miRNA的芯片研究[14],其中miR-30家族有明显差异表达,因此本研究选择了miR-30d-5p进行深入探讨。

本研究收集了OMDT患者的血清后提取外泌体,并对其进行鉴定。目前普遍认为外泌体的直径在30～150 nm之间,微囊泡的直径一般在100～1 000 nm之间,本研究结果中显示其直径约为200 nm,属于粒径偏小的一部分,参考相关文献后依然选择外泌体对其进行描述[15]。电镜结果显示其呈圆形、椭圆形,具有双层脂质包膜结构,Western blot结果显示其表面的特殊蛋白CD9、Flotollin-1和HSP70表达呈阳性,与文献报道的结果一致[16],为后续研究奠定了基础。qRT-PCR结果显示,OMDT患者发病高峰期时血清外泌体的miR-30d-5p水平明显降低,并且与AST、ALT和GGT指标呈现负相关,推测血清外泌体miR-30d-5p可能参与了OMDT患者的肝脏损伤的过程。

对miR-30d-5p进行靶基因的预测及生物学信息分析结果显示,miRWalk及miRBD数据库共预测到46个miR-30d-5p的可能靶点,其中RHOB是一种小的GTP酶,属于GTPase信号分子家族,是细胞分裂、膜泡运输、伤口愈合或免疫监视等多种细胞和生理过程中的关键介质,同时还被发现参与非酒精性脂肪肝病、肝纤维化等多种肝脏损伤[17],这与GO分析结果高度相似。KEGG结果显示了RHOB可能参与的信号通路,其中包括cAMP、Wnt、calcium在内的大多数都与免疫性肝病密切相关。miR-30d-5p与RHOB的靶向关系在多个网站被预测到(http://www.targetscan.org、http://genome.ucsc.edu),双荧光素酶报告基因结果显示,miR-30d-5p模拟物可特异性靶向结合RHOB的3′-UTR序列,说明miR-30d-5p可以负向调控RHOB的表达,本研究虽然未能检测OMDT患者肝脏的RHOB表达水平,但是在课题组正在进行的TCE致敏小鼠模型研究基础上发现致敏阳性鼠的肝脏组织中RHOB基因表达水平明显升高,提示RHOB有望成为OMDT的治疗靶点之一。

综上所述,OMDT患者血清外泌体miR-30d-5p表达水平降低,与肝脏损伤程度呈负相关,并且本研究确定了miR-30d-5p与RHOB基因的靶向调控关系,为深入研究OMDT患者肝损伤的具体调控机制提供了指导方向,但本研究实验中并未对miR-30d-5p的表达进行干预,因此还需要进一步研究以获得确定性的结论。