Sigirr缺失调控NF-κB并参与慢性肾病小鼠发生肾间质纤维化

童子文,徐德苹,王 喆,杨 萍,涂珍珍,臧丹丹,周海胜,

单一免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关受体(single immunoglobulin interleukin-1 related receptor,SIGIRR)介导的信号通路具有抑制白细胞介素(interleukin,IL)-1的活性。前期研究[1]发现NF-κB/SIGIRR负调控IL-1β诱导的肾小管上皮-成纤维细胞转分化。研究[2-4]证实在IL-1的刺激下, SIGIRR以配体依赖性方式与IL-1受体复合物相互作用。肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis ,RIF) 是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)发展过程中常见的病理改变[5],其发病机制是与炎症因子、细胞因子和转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1 等活化相关信号通路有关[6-7]。目前研究CKD并发RIF的模型主要是通过单侧输尿管的结扎术诱发的急性肾损伤的大鼠模型[8]。但其与临床上常见的慢性肾病并发RIF的过程具有较大差异性。为探讨SIGIRR在CKD并发RIF中的作用,该研究拟使用Sigirr基因敲除小鼠(Sigirr-/-)在高嘌呤饮食诱发肾脏慢性损伤,建立CKD并发RIF小鼠模型,观察RIF的病理特点及SIGIRR在RIF发生过程中作用和机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂野生型C57BL/6(Sigirr+/+)小鼠、Sigirr-/-小鼠购自南京集萃药康股份有限公司,饲养于 SPF 级的动物房,饲养条件为恒温(22±2)℃,湿度60%,明暗周期为12 h/12 h,小鼠体质量(22±2)g。所有动物实验均遵循《实验动物护理和使用指南》和安徽医科大学伦理指南(伦理号:LISC20200007)。鼠源E-cadherin抗体、兔源Vimentin抗体、兔源 α-SMA 抗体、兔源P65抗体、兔源p-P65抗体、 抗鼠或兔抗体购买于美国 Cell Signaling Technology 公司。鼠源 IL-1β 抗体、兔源TGF-β1抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。鼠源 p-p65 抗体购自上海圣克鲁兹生物技术有限公司。琼脂凝胶糖粉购自于北京擎科生物科技有限公司。免疫组织化学试剂盒、DAB显色液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。改良 Masson 三色染色液购自北京索莱宝科技有限公司。正常小鼠饲料和含有0.2%腺嘌呤的高腺嘌呤饲料均购自于无锡戴茨生物科技有限公司。PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。用于PCR检测小鼠基因组DNA的Sigirr敲除引物: P1:5′-TTCCAGTAGTCGGTTCTGA-ACTCAG-3′,P2:5′-TGTGGAGGTCAAACCTCTTAGG-3′,PCR扩增产物为900 bp;用于PCR检测野生型Sigirr的引物:P3:5′-AGCCTAAATCTGCAATCTCTCCC-3′,P4:5′-GAAACCTGTGCCCTAATCCATG-3′,PCR扩增产物为496 bp;引物均是由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 CKD并发RIF小鼠模型的建立取7～8周龄的Sigirr+/+小鼠和Sigirr-/-小鼠各8只, 均为雄性小鼠。将小鼠随机进行分组,包括高腺嘌呤喂养组:即高腺嘌呤饲料喂养12周(4只Sigirr+/+、4只Sigirr-/-鼠);正常饲料喂养的对照组:正常饲料喂养12周(4只Sigirr+/+、4只Sigirr-/-鼠)。12周后,异氟烷麻醉小鼠,眼眶静脉丛采血用于后续生化分析,处死,取两肾脏分别固定于4%多聚甲醛和放在-80 ℃冰箱中,备用。

1.3 各组小鼠肾组织病理学检查小鼠肾组织常规脱水包埋、切片,烤片、脱蜡至水。进行HE 染色和Masson染色,中性树脂封片,镜下观察拍照。

1.4 免疫组织化学分析(immunohistochemistry analysis,IHC)切片脱蜡至水,利用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复, 3%过氧化氢溶液覆盖组织阻断过氧化物酶,4 ℃孵育一抗过夜,孵育增强剂,孵育二抗,DAB显色,苏木精核染,盐酸酒精分化,脱水封片,拍照分析。

1.5 Western blot实验取冻存小鼠肾组织每组50 mg,裂解液提取总蛋白,配置10% SDS-PAGE胶,每孔蛋白上样6 μl,电泳分离、转膜,然后5%脱脂奶粉室温下封闭2 h,4 ℃孵育一抗过夜,洗膜。对应二抗室温孵育2 h,洗膜、蛋白条带加ECL曝光显色。用凝胶图像处理系统(Image J 软件)得出灰度值。

1.6 小鼠基因型的PCR鉴定剪去一段小鼠鼠尾,常规提取鼠尾的基因组DNA作为模板。扩增结束,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果

2.1Sigirr-/-小鼠基因型鉴定提取Sigirr-/-小鼠和Sigirr+/+小鼠鼠尾基因组,分别利用敲除引物和WT引物进行PCR扩增。结果显示Sigirr-/-小鼠基因组在P1-P2引物扩增后900 bp特异条带,但P3-P4引物扩增显示阴性结果;Sigirr+/+小鼠基因组在引物扩增获得496 bp的特异性条带,而P1-P2引物扩增未出现条带(图1)。因此,拟建立模型的小鼠为C57BL/6品系Sigirr-/-和Sigirr+/+纯合小鼠。

图1 PCR鉴定小鼠鼠尾基因组DNA的Sigirr基因

2.2 CKD并发RIF小鼠模型的建立及相关指标比较按照图2A的方案,采用高腺嘌呤饲料和正常饲料喂养Sigirr-/-小鼠和Sigirr+/+小鼠,持续时间为12周。观察发现:高腺嘌呤饲料喂养小鼠的肾脏颜色显示黄白色,硬度较对照组明显增加;且肾脏内含大量积液,液体呈黄褐色浑浊样,并有明显的肾肿胀伴有颗粒状和肾盂积水现象,对照组小鼠肾脏肉眼未见异常(图2B)。

图2 CKD并发RIF小鼠模型建立

肾功能检测结果显示两组小鼠血清尿素氮和肌酐比较差异有统计学意义(F=92.10,P<0.001;F=16.5,P<0.001)。与高嘌呤喂养Sigirr+/+组小鼠比较,高嘌呤喂养组Sigirr-/-小鼠血清尿素氮水平升高,差异有统计学意义(均P<0.01)。与正常饲料喂养组Sigirr+/+小鼠和Sigirr-/-小鼠比较,高嘌呤喂养组Sigirr+/+小鼠和Sigirr-/-小鼠的血清尿素氮(均P<0.001)和肌酐(P<0.05,P<0.01)水平升高,差异有统计学意义(图2C、D)。

HE染色显示对照组的小鼠肾组织形态及结构正常,在高嘌呤喂养组小鼠肾脏中观察到肾小管扩张和大量炎性细胞浸润且出现肾小球硬化等形式的肾损伤,且Sigirr-/-小鼠肾脏组织中,炎性细胞浸润、小球充血等病理变化较对照组更明显(图2E)。

Masson染色结果显示:高腺嘌呤饲料喂养组出现蓝色沉积;与对照组肾脏组织比较,高腺嘌呤喂养组小鼠肾脏中胶原沉积显著增加,且Sigirr-/-小鼠肾组织的胶原沉积较Sigirr+/+小鼠更严重(图2E)。

2.3Sigirr基因缺失对IL-1β活化MyD88/NF-κB信号通路的影响利用IHC检测模型小鼠肾脏组织中IL-1β的表达水平。结果显示:CKD-RIF模型小鼠肾脏组织中,IL-1β表达水平较对照组肾脏组织显著增加;且Sigirr基因缺失时,IL-1β的增加更明显(图3A)。进一步利用IHC检测其下游信号分子MyD88和磷酸化P65(p-P65)的变化。结果发现,伴随CKD-RIF小鼠的肾组织中的IL-1β表达升高,与对照组比较,MyD88、p-P65的均明显增加;特别是与 CKD-RIF模型的Sigirr+/+小鼠的肾组织比较,CKD-RIF的Sigirr-/-小鼠肾组织增加较更明显。同时用新鲜肾组织,提取总蛋白进行Western blot分析,结果显示(图3B、C):Sigirr-/-和Sigirr+/+的CKD-RIF小鼠的肾组织比对应的非模型组小鼠肾组织中IL-1β表达水平均明显增加,且Sigirr-缺失的CKD-RIF小鼠较Sigirr+/+组显著增加(P<0.001);MyD88、p-P65变化与IHC的结果一致,且差异均有统计学意义 (P<0.001)。

图3 IHC、Western blot检测模型小鼠的肾组织IL-1β、MyD88、p-P65变化

2.4 TGF-β1介导的肾间质上皮-肌成纤维细胞转化(epithelial-myofibroblast transition,EMT)促进CKD-RIF的发生利用IHC检测各组模型小鼠的肾组织中的TGF-β1、E-cadherin、Vimentin等表达水平。结果显示:与对照组的小鼠肾脏组织比较,发生RIF小鼠的肾组织中的TGF-β1表达水平明显升高(图4A); RIF小鼠肾组织中,E-cadherin表达降低同时Vimentin增加,且Sigirr-/-小鼠肾脏中E-cadherin的减少和Vimentin的增加比Sigirr+/+小鼠更为明显(图4B)。同时利用分离获取的新鲜肾组织,提取总蛋白进行免疫印迹分析,结果显示(图4C):Sigirr-/-和Sigirr+/+的CKD-RIF小鼠的肾组织比对应的非模型组小鼠肾组织中α-SMA表达水平均明显增加,且Sigirr-/-的CKD-RIF小鼠较Sigirr+/+的CKD-RIF小鼠显著增加(P<0.01,P<0.001);E-cadherin、Vimentin变化与IHC的结果一致,且差异均有统计学意义(P<0.001)。

3 讨论

炎症反应可以诱发CKD发生RIF。CKD并发RIF在病理上表现为EMT且伴随肾间质炎症细胞浸润[9]。目前在研究RIF的模型大多数是采用单侧输尿管结扎的大鼠模型,与临床上RIF的病因和发病机制方面存在较大差异。采用腺嘌呤饲料喂养小鼠引起肾脏慢性损伤在探讨CKD-RIF机制具有一定的优势。本研究使用0.2%腺嘌呤饲料喂养小鼠12周后,发现肾脏显示为黄白色,且肾组织内含大量黄褐色浑浊样积液,有明显的肾肿胀伴有颗粒状和肾盂积水现象。其原因可能是小鼠体内形成了溶解度较低的2,8-二羟基嘌呤,导致肾损伤肾积水[10]。更重要的是肾功能检测高嘌呤喂养组小鼠血清尿素氮和肌酐高于对照组小鼠。HE染色显示高嘌呤饮食组小鼠肾脏组织粒细胞进入肾小管管腔、肾小管萎缩且出现肾小球硬化。因此,利用腺嘌呤饲料喂养小鼠成功建立了慢性肾脏损伤的小鼠模型。

持续慢性肾脏损伤容易诱发RIF,主要病理变化是细胞外基质聚集在肾间质和肾小管周围,导致肾脏的纤维化和硬化[8]。本研究Masson染色的结果显示:肾间质中出现大量蓝色条索状沉淀,提示CKD并发RIF造模成功。在对肾脏组织进行IHC和Western blot分析,显示上皮细胞的标记分子E-cadherin表达显著降低,而成纤维细胞标记分子Vimentin和肌成纤维标记分子α-SMA表达增加。证实腺嘌呤诱发慢性肾脏损伤导致RIF与EMT的发生有关。

IL-1β是一种常见的促炎症、促纤维化的细胞因子,在CKD及其并发的RIF过程中发挥重要作用。IL-1β通过结合IL-1受体,依赖MyD88进而激活NF-κB信号通路,增加TGF-β1 的表达[2,8,11]。TGF-β1是EMT的重要诱导分子,促进RIF的发生和发展。通过检测肾脏组织中 IL-1β 、MyD88、p-P65和 TGF-β1,结果发现高嘌呤喂养组小鼠肾脏组织,IL-1β 、MyD88和 TGF-β1等分子均显示较高表达水平,而且与P65的活化状态保持一致性。因此腺嘌呤饮食诱发CKD-RIF的机制是依赖于IL-1β激活NF-κB/TGF-β1信号通路,促进RIF。

SIGIRR作为IL-1β的负性调控分子,能与IL-1受体和其他信号分子如MyD88相互作用,从而抑制IL-1β/IL-1受体介导NF-κB信号通路的活化[12-13]。为进行体内研究SIGIRR在CKD-RIF发生中作用,利用Sigirr基因敲除小鼠,通过喂养腺嘌呤饲料建立CKD-RIF模型。与Sigirr+/+的模型小鼠比较,肾功能、肾脏的大体形态、组织结构、Masson染色等表型变化,Sigirr-/-肾脏损伤更为严重,纤维化程度更明显;同时IHC和Western blot分析证实:CKD-RIF的Sigirr-/-小鼠肾脏组织中Vimentin、α-SMA表达均较Sigirr+/+肾组织显著增加,E-cadherin的表达显著减少。因此,Sigirr缺失加剧肾脏慢性损伤,促进RIF。蛋白质水平检测结果发现:CKD-RIF的Sigirr-/-小鼠肾脏组织中 IL-1β 、MyD88、p-P65比CKD-RIF的Sigirr+/+的模型小鼠肾脏组织明显增加。因此,Sigirr基因缺失加剧RIF的发生发展,这是与增强IL-1β/NF-κB/TGF-β1信号通路的活性有关。

综上所述,利用高腺嘌呤饲料较长时间喂养小鼠,可以建立CKD并发RIF的小鼠模型,在此模型中,主要是通过IL-1β活化NF-κB/TGF-β1信号通路,使肾间质发生EMT;SIGIRR作为IL-1β的负性调控分子,Sigirr基因的缺失有利于活化IL-1β/NF-κB/TGF-β1信号通路,促进RIF的发生发展。