扁桃酸对肺腺癌H1299细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响及其机制

陆海青,李艳丽,华兹涵,肖佳欣,凌 博,叶广彬

中医药防治肺癌广泛应用于临床,且在疗效和预后中具有其独特的优势[1-2]。以苦杏仁为核心组方药物的薯蓣丸、清气化痰丸和益肺清化膏,均可明显改善肺癌患者的临床疗效,尤其在增强患者放化疗的疗效、缓解咳喘等临床症状和提升生活质量方面优势明显[3-4]。研究[5-7]表明,苦杏仁苷是苦杏仁抗肿瘤的核心有效成分,苦杏仁苷抗肿瘤的部分作用是由其催化产物所实现的,如肿瘤细胞无法代谢氢氰酸(苦杏仁苷催化产物),故诱导肿瘤细胞凋亡。但是,同为苦杏仁苷催化产物的扁桃酸,在肺腺癌中的作用及机制尚不清楚。该研究以不同浓度扁桃酸干预肺腺癌H1299细胞,分析肺腺癌细胞增殖、凋亡和迁移能力的变化,聚焦相关通路蛋白的检测,从而整体分析扁桃酸抗肺腺癌细胞的作用和机制,继而为苦杏仁及苦杏仁苷对肿瘤治疗的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料人肺腺癌H1299细胞购于中国科学院细胞库。基础培养基DMEM、10%胎牛血清(美国Gibco公司)制备完全培养基,0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)用于细胞消化。扁桃酸购于美国Sigma公司,用DMSO溶解,制备成母液(500 μg/ml),进行滤膜过滤除菌除杂质,再用培养基稀释成不同浓度备用。CCK-8试剂购于中国Biosharp公司;Hoechst 33258和PI试剂购于北京索莱宝科技有限公司;Matrigel基质胶和Transwell小室购于美国BD公司;Western blot实验基础试剂:SDS-PAGE凝胶试剂盒、BCA检测试剂盒和ECL超敏显影试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司;stat3、p-stat3、bax、bcl-2、caspase-3、cl-caspase-3、MMP-9、Vimentin和β-tubulin单克隆抗体均购于艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.2 方法

1.2.1CCK-8检测 取对数期生长的H1299细胞制成细胞悬液,计数并接种于96孔板,每孔接种100 μl(6×104个/孔),设置6个复孔。待细胞长满后,更换含不同浓度扁桃酸(0、5、7.5、10和20 μg/ml)的完全培养基,分别培养24 h和48 h。弃培养基,再分别滴加CCK-8溶液(10 μl/孔),培养箱中孵育4 h后,用酶标仪在450 nm波长下检测各孔的吸光度值,计算细胞增殖抑制率并绘制曲线。

1.2.2Hoechst 33258/PI双染 取对数期生长的H1299细胞制成细胞悬液,调整细胞密度并接种到6孔板中(2×105个/孔)培养。实验组给予10 μg/ml和20 μg/ml扁桃酸,对照组给予0 μg/ml扁桃酸干预24 h。收集细胞,加入4%多聚甲醛固定4 ℃ 10 min,1 000 r/min离心3 min弃上清液,加入1 ml预冷 PBS重悬细胞沉淀,1 000 r/min离心3 min弃上清液,滴加100 μl Hoechst 33258和PI混合工作液重悬细胞沉淀,室温避光染色 10 min,加入1 ml预冷 PBS洗涤,1 000 r/min离心3 min弃上清液,残留上清液50 μl重悬细胞,加入10 μl抗荧光淬灭剂。取10 μl细胞悬液滴至载玻片,置于倒置荧光显微镜下拍照。凋亡细胞的判定标准为细胞呈高蓝光低红光。

1.2.3划痕实验 取对数期生长的H1299细胞制成细胞悬液,调整细胞密度并接种到6孔板中(2×105个/孔)培养。待细胞长满后,用10 μl枪头在孔内竖线划痕,并添加含不同浓度扁桃酸(0、5、7.5和10 μg/ml)的无血清培养基进行干预。培养24 h后,用显微镜进行观察孔内细胞的愈合情况,拍照。

1.2.4Transwell迁移实验 将孔径0.8 μm小室放入24孔板中,0.25%胰酶消化处理后的H1299细胞,离心去上清液,PBS洗涤2遍,用无血清培养基重悬细胞,计数并调整细胞密度为2×105个/ml。取100 μl细胞悬液加入小室,同时在Transwell下室分别加入600 μl含不同浓度扁桃酸(0、5、7.5和10 μg/ml)的完全培养基,培养24 h后,用4%多聚甲醛固定和1%结晶紫染色,PBS洗涤3次,棉签轻轻擦去上层未迁移的细胞,显微镜下随机选取3个视野,利用Image J进行细胞计数。

1.2.5Transwell侵袭实验 0.25%胰酶消化对数生长期H1299细胞,用无血清培养基重悬细胞,调整细胞密度至2×105个/ml。Transwell下室分别加入600 μl含不同浓度扁桃酸(0、5、7.5和10 μg/ml)的完全培养基,上室先铺水化的BD胶基底膜,再加100 μl细胞悬液。培养24 h后,用4%多聚甲醛固定和1%结晶紫染色,PBS洗涤3次,棉签轻轻擦去上层未迁移的细胞,显微镜下随机选取3个视野,利用Image J进行细胞计数。

1.2.6Western blot检测 不同浓度扁桃酸(0、5、10和20 μg/ml)干预H1299细胞后,取细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳,转膜。PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2 h,TBST洗涤3遍,添加一抗(一抗稀释液1 ∶2 000稀释)后4 ℃静置过夜。TBST洗涤3遍,二抗(5%脱脂奶粉1 ∶1 000稀释)室温孵育2 h。取出PVDF膜滴加ECL显影液,在凝胶成像系统下显影成像,用Image J分析蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1 扁桃酸抑制肺腺癌H1299细胞增殖为研究不同浓度扁桃酸对肺腺癌细胞H1299增殖的影响,用不同浓度扁桃酸分别作用于H1299细胞24 h和48 h,从而确定扁桃酸的时效和量效。结果表明,不同浓度扁桃酸对H1299细胞的增殖活力均有抑制作用(24 h:F=51.6,P<0.001;48 h:F=253.7,P<0.001),提示扁桃酸可以抑制肺腺癌H1299细胞增殖(图1)。

图1 扁桃酸对H1299细胞增殖能力的影响

2.2 扁桃酸诱导肺腺癌H1299细胞凋亡采用Hoechst 33258联合PI双染可以较好区分活细胞和细胞的凋亡、坏死。结果表明,不同浓度扁桃酸处理肺腺癌H1299细胞24 h后,实验组(10 μg/ml和20 μg/ml )细胞凋亡(细胞呈高蓝光低红光)数量均明显高于对照组(0 μg/ml),提示扁桃酸可诱导肺腺癌H1299细胞凋亡(图2)。

图2 扁桃酸对H1299细胞凋亡的影响 ×400

2.3 扁桃酸降低肺腺癌H1299细胞的侵袭迁移划痕实验结果显示,不同浓度扁桃酸处理H1299细胞24 h后,实验组的细胞迁移率均明显低于对照组(F=332.7,P<0.001)。Transwell迁移实验结果显示,不同浓度扁桃酸处理H1299细胞24 h后,实验组的细胞迁移数[5 μg/ml:(1 552.33±48.13)个/视野;7.5 μg/ml:(611.67±124.71)个/视野;10 μg/ml:(266.33±23.07)个/视野]均明显低于对照组的细胞迁移数[0 μg/ml:(2 044.67±41.86)个/视野],差异有统计学意义(F=532.6,P<0.001)。以上结果提示扁桃酸可以抑制肺腺癌H1299细胞迁移。见图3。

图3 扁桃酸对H1299细胞侵袭迁移能力的影响 ×40

Transwell侵袭实验结果显示,不同浓度扁桃酸处理H1299细胞24 h后,实验组的细胞穿透数[5 μg/ml:(464.00±69.42)个/视野;7.5 μg/ml:(65.67±26.31)个/视野;10 μg/ml:(28.00±14.73)个/视野]均明显低于对照组的细胞穿透数[0 μg/ml:(657.67±101.12)个/视野],差异有统计学意义(F=65.94,P<0.001),这提示扁桃酸可以抑制肺腺癌H1299细胞侵袭。见图3。

2.4 扁桃酸对相关通路bax/caspase-3、MMP-9和Vimentin的蛋白表达影响不同浓度扁桃酸处理H1299细胞24 h后结果如图4所示。与对照组(0 μg/ml)比较,实验组(5、10和20 μg/ml )中的细胞凋亡相关蛋白cl-caspase-3/caspase-3明显表达上升(F=1816,P<0.001),bcl-2/bax明显表达降低(F=1855,P<0.001);而细胞侵袭迁移相关蛋白MMP-9(F=336.2,P<0.001)和Vimentin(F=358.9,P<0.001)明显表达降低。这提示扁桃酸可以诱导肺腺癌细胞H1299凋亡,并抑制H1299细胞上皮间质转化,从而达到抑制细胞侵袭迁移的作用。

图4 扁桃酸对细胞凋亡和侵袭迁移相关蛋白表达的影响

2.5 扁桃酸对stat3信号通路的影响不同浓度扁桃酸处理H1299细胞24 h后结果如图5所示。与对照组(0 μg/ml)比较,不同浓度扁桃酸均能降低p-stat3/stat3的表达(F=236.4,P<0.001),抑制stat3磷酸化水平,从而导致stat3信号通路失活,这提示扁桃酸可以抑制stat3信号通路的激活。

图5 扁桃酸对stat3蛋白表达的影响

3 讨论

扁桃酸是苦杏仁苷催化产物中非常重要的类型。目前扁桃酸的临床应用和研究主要集中在抗炎、镇痛和抗菌,与肿瘤的相关性研究不明确[8]。为分析扁桃酸与抗肿瘤活性的相关性,本研究用不同浓度扁桃酸对肺腺癌H1299细胞进行干预,发现扁桃酸可抑制肺腺癌H1299细胞的增殖活性。肺癌研究[9-10]显示,stat3被活化后形成p-stat3蛋白,继而提升其促进肿瘤细胞增殖的作用。本研究证实扁桃酸可抑制肺腺癌H1299细胞中p-stat3的表达,继而抑制stat3的活化。鉴于stat3活化是肺癌细胞增殖的核心调控通路,扁桃酸抑制stat3的活化是其降低H1299细胞增殖的有效机制之一。同时,分析了扁桃酸对肺腺癌H1299细胞凋亡水平的影响,结果表明扁桃酸可显著提升H1299细胞的凋亡水平。在肺腺癌细胞的凋亡途径中,bax是经典的促凋亡蛋白,接受凋亡信号后进入线粒体膜,破坏线粒体膜的完整性,继而促进线粒体释放细胞色素C,继而发挥caspase的破坏细胞结构和诱导细胞凋亡的作用[11]。本研究结果表明扁桃酸显著提升H1299细胞中bax的表达。证实了扁桃酸促凋亡的机制与bax信号轴关系密切。bax促进线粒体释放细胞色素C中,caspase-3起到关键作用,也是其经典的下游通路蛋白,然而caspase-3行使其功能,需要在细胞内活化成cl-caspase-3[12]。因而采用Western blot检测了cl-caspase-3的表达量,发现扁桃酸显著提升H1299细胞中cl-caspase-3的表达。由此可以得出,扁桃酸促bax信号轴的下游效应蛋白为caspase-3,即可促进bax下游caspase-3的活化。提示bax/caspase-3信号轴是潜在的扁桃酸诱导H1299细胞凋亡的作用通路之一。

肿瘤细胞侵袭迁移能力变化也是评价潜在抗癌药物的核心指标之一[13]。本研究用划痕和Transwell实验证实扁桃酸显著降低肺腺癌H1299细胞的侵袭迁移能力。研究[14]表明,MMP-9发挥着降解细胞外基质和降低细胞黏附力的功能,故被认为是肿瘤细胞获得侵袭转移能力的起始因素之一。Vim-entin蛋白是肿瘤细胞运动过程中的关键骨架蛋白,通过促进肿瘤细胞伪足形成,来提升肿瘤细胞的上皮-间质转化,继而提升其侵袭运动能力[15]。本研究的结果证实扁桃酸降低肺腺癌H1299细胞中MMP-9和Vimentin蛋白的表达。鉴于MMP-9和Vimentin蛋白的功能,可以得出扁桃酸通过降低MMP-9和Vimentin蛋白的表达,抑制肿瘤细胞外基质的降解和上皮间质转化,从而抑制H1299细胞的侵袭迁移能力。

综上所述,扁桃酸抑制stat3的活化是其降低H1299细胞增殖的有效机制之一;扁桃酸诱导H1299细胞凋亡与bax/caspase-3信号轴的活化关系密切;扁桃酸通过降低MMP-9和Vimentin蛋白的表达,与其抑制H1299细胞的侵袭转移能力密切相关。