相恶药对对白鲜皮主要成分含量的影响

康靖杰,李欣然,贾天柱,夏林波,尹海波,陈晓霞

(辽宁中医药大学,辽宁 大连 116600)

中药白鲜(DictamnusdasycarpusTurcz.)是多年生草本植物芸香科(Rutaceae)白鲜的根皮,主要分布于黑龙江、甘肃、新疆、安徽、朝鲜、蒙古和俄罗斯等[1]。汉代《神农本草经》首次记载了这种植物适应性强,喜欢温暖潮湿的环境,但不喜积水[2],通常被用作传统的医药治疗湿疹、湿热疮毒、风疹、疥疮、麻风病、风湿热痹、黄疸红尿等。传统的中医理论认为该药具有热、清、湿、燥、散风、解毒之功效,常用于治疗荨麻疹和其他疾病特应性皮炎。到目前为止,已有200多种化合物被提取并鉴定为白鲜皮中的生物碱、糖苷类、萜类及其衍生物[3,4]。其中,白鲜碱、黄柏酮和梣酮是白鲜皮的主要成分。现代药理学研究表明,白鲜碱具有抗真菌、强心、松弛血管、抗血小板聚集、抗皮肤光损害、抗癌等作用;梣酮具有抑菌、杀虫、保肝降酶、抑制肝纤维化等生物活性;黄柏酮具有降血糖、抗癌等活性作用[5]。

相恶是中药七情配伍的重要组成部分,其内涵在历代本草中不尽相同。在历代古本草医籍中多从两方面定义相恶:一种是药物本身受到其他药物制约;另一种是可制约其他药物毒副作用[6]。作为中药七情配伍之一,相恶最早见于汉代《神农本草经》:“勿用相反相恶者。”尽管相恶被视作配伍禁忌,然而历代医家使用相恶药对同用的方剂却不鲜见[7]。古籍《新修本草》和《名医别录》中均记载有白鲜恶桑螵蛸、茯苓、桔梗、萆薢,其相恶的原理以及是否在配伍过程中影响白鲜皮主要化学成分含量,值得研究。因此,本实验采用HPLC法对白鲜分别与桑螵蛸、茯苓、桔梗、萆薢配伍后白鲜中三种主要化学成分白鲜碱、黄柏酮和梣酮的含量进行测定,并通过改变不同配伍比例探讨与白鲜皮相恶的四种药物对白鲜皮三种成分含量的影响规律,为揭示白鲜皮相恶原理提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 白鲜皮购于康美药业股份有限公司,经辽宁中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为四年生芸香科植物白鲜的根皮;桑螵蛸(产地:山东)、茯苓(产地:湖北)、桔梗(产地:河北)、萆薢(产地:亳州)均购于辽宁省大连市海王星辰健康大药房,经辽宁中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定均为正品。白鲜碱对照品(纯度≥98 %,江苏永健医药科技有限公司,批号:YJ0102);黄柏酮(纯度≥98%,中国食品药品鉴定研究院,批号:111923-20160);梣酮对照品(纯度均≥98%,中国食品药品鉴定研究院,批号:111700-201603);甲醇(色谱纯,天津科密欧有限公司)。

1.1.2 仪器 高效液相色谱仪(安捷伦公司,美国,型号:1260 Agilent型);十万分之一电子天平(岛津公司,日本,型号:AUW220D型);电热恒温水浴锅(上海赫田科学仪器有限公司,型号:HH-M4型);小型粉碎机(温州顶力医疗器械有限公司,型号:DFT-300型);超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司,型号:KQ5200DE型);电热鼓风干燥箱(天津泰斯特仪器有限公司,型号:101-2A型)。

1.2 方法

1.2.1 白鲜皮单煎膏制备 称取白鲜皮5.00g,加入12倍量的水煎煮1h;然后再加入10倍量的水煎煮1h,趁热抽滤,蒸干;烘箱烘干成浸膏,计算浸膏率。

1.2.2 白鲜皮合煎膏制备 称取白鲜皮5.00g,分别加入不同量的桑螵蛸、茯苓、桔梗或萆薢,配制成1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的药对,按照单煎膏方法制备,计算浸膏率。

1.2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取白鲜碱、黄柏酮和梣酮对照品9.30、10.15、10.66mg,加甲醇依次定容至25、10、10mL容量瓶中,然后精密移取白鲜碱、黄柏酮和梣酮对照品溶液各0.75、1.25、0.5mL混合均匀,配制为混合对照品母液,低温、避光保存。

1.2.4 供试品溶液的制备 依据单煎、合煎药材所得浸膏率折合含白鲜皮生药量为1.00g,称取浸膏溶于25 mL无水甲醇中,滤过;13 000r离心10min,取上清,0.45μm微孔滤膜滤过,得白鲜皮单煎及不同配比合煎液供试品溶液,置冰箱4℃冷藏保存。

1.2.5 色谱条件 色谱柱为C18;流动相为甲醇(A):水(B)(55∶45),流速为1.0mL/min;柱温为40℃;进样量为10μL;检测波长为236nm;理论塔板数应≥5 000。

1.2.6 含量测定 取白鲜皮单煎样品及不同配比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)合煎样品,按“1.4”项下色谱条件分别进样,双样双针,每份样品测定2次,记录峰面积,计算白鲜皮中白鲜碱、黄柏酮和梣酮的含量及RSD值。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 标准曲线 精密移取一定量白鲜碱、黄柏酮和梣酮对照品储备液混合均匀,将对照品溶液逐级稀释2、4、10、20、40、100、200、400、1 000倍,取各混合对照品10μL按“1.2.5”项下色谱条件注入高效液相色谱中。以对照品溶液测得的峰面积为纵坐标(y),浓度为横坐标(x),绘制标准曲线,计算回归方程。其线性考察结果,见表1。

表1 白鲜碱、黄柏酮和梣酮的线性方程线性范围和相关系数

1.白鲜城 2.黄柏酮 3.梣酮

表2 白鲜碱、黄柏酮和梣酮的加样回收率试验结果

2.1.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10μL,按“1.2.5”项下色谱条件连续进样6次,记录峰面积。结果白鲜碱、黄柏酮、梣酮的色谱峰峰面积RSD值分别为2.39%、2.98%、2.57%,表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性考察 取白鲜皮-茯苓(1∶1)供试品溶液,分别于 0、2、4、6、8、10、12、24、48h 按“1.2.5”项下色谱条件进样测定,进样量为10μL,记录峰面积并计算RSD。48h 内白鲜碱、黄柏酮、梣酮色谱峰面积的RSD值依次为2.43%、3.21%、2.66%,表明供试品溶液在48h内稳定性良好。

2.1.4 重复性考察 取同一批药材样品白鲜皮-茯苓(1∶1),称取6份,每份约1.0g,按“1.2.4”项下方法制备供试品溶液,在“1.2.5”项下色谱条件进样10μL,进行测定,记录白鲜碱、黄柏酮和梣酮峰面积的RSD值为1.43%、3.36%、1.03%,表明该方法重复性良好。

1.白鲜城 2.黄柏酮 3.梣酮

2.1.5 加样回收率试验 精密称取白鲜皮-茯苓(1∶1)粉末6份,分别精密加入白鲜碱、黄柏酮和梣酮混合对照品溶液5、1、1mL,按供试品溶液方法制备,按“1.2.5”项下色谱条件进样测定,计算回收率及RSD,结果见表 2。白鲜碱、黄柏酮、梣酮3个成分的平均加样回收率及RSD均符合相关规定。

2.2 白鲜皮相恶药对含量测定分析

白鲜皮单煎与合煎各组分成分溶出度测定结果比较:白鲜皮与萆薢或桑螵蛸合煎液中白鲜碱、黄柏酮、梣酮成分比单煎液中的含量明显降低,但萆薢合煎液成分含量较后者更低;白鲜皮与茯苓或桔梗合煎液中,此3个成分含量较单煎液高。可知白鲜皮-萆薢或桑螵蛸配伍时降低了这3种成分总量的溶出;而与茯苓或桔梗配伍后较有利于成分的溶出。

在不同配伍配比的白鲜皮相恶药对中,随着白鲜皮-茯苓配伍比例的增加,白鲜碱、黄柏酮的含量随之增多,梣酮的含量随着茯苓比例的增加而减少;随着白鲜碱-桔梗或萆薢配伍比例的增加,3种成分含量趋向于被抑制,但白鲜皮-桔梗不同配比对梣酮含量的影响并未表现出明显的规律性;白鲜皮-桑螵蛸的不同配伍比例对白鲜碱、黄柏酮、梣酮含量影响较小。另外,白鲜皮-桑螵蛸药对配伍比例为1∶1时,3种成分含量最高。结果见表3和图3。

注:a.白鲜碱;b.黄柏酮;c.梣酮。

表3 样品的含量测定结果

2.3 讨论

经典的煎煮工艺多为水煎剂,提取的药用成分也多为水溶性成分。基于此,采用水煎煮的方法来制备供试溶液,使其能最大程度地反映药对的物质基础[8]。在多组分含量测定中,还考察了不同溶剂(50%甲醇、无水甲醇、水等)对白鲜皮相恶药对含量的影响。结果表明,以水作为溶剂时,药物中白鲜碱的峰面积明显减小,黄柏酮与梣酮几乎没有峰;当50%甲醇作为溶媒时,黄柏酮、梣酮在药对中的峰面积增加。因为白鲜皮的化学成分大多不溶于水,是含有挥发油、柠檬苦素、黄酮类等易溶于有机溶剂的成分;随着化学成分在白鲜皮中的溶出度降低,也间接影响其他药物化学成分的溶出度。因此,无水甲醇最终被用作本研究的溶媒。为了更好地分离出白鲜皮相恶药对中三种主要成分含量,建立了同时测定白鲜皮相恶药对中三种成分含量的分析方法。该方法操作简便、特异性好、结果准确可靠,为白鲜皮相恶药对的多指标成分综合评价提供了一种分析方法。结合配伍前后各组分含量的变化,可为白鲜皮药对的临床配伍和研究提供科学依据。

实验显示不同配伍比例的白鲜皮相恶药对对白鲜皮中化学成分含量会产生影响。据文献研究表明,茯苓作为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核,主要含有三萜类、多糖类、二萜类、甾醇类等成分[9]。桔梗有止咳平喘、抗炎抑菌、抗肿瘤、降血糖、抗氧化、保肝等作用;在桔梗中发现的化学成分有三萜皂苷类、黄酮类、无机元素等成分[10]。据报道,黄柏酮、梣酮作为柠檬苦素类化合物在植物体内主要通过三萜类化合物合成的,其前体化合物一般认为是大戟烷型或甘遂烷型[11]。作为芸香科植物的主要特征化学成分,根据其合成途径推测,随着茯苓或桔梗的加入,白鲜皮与其三萜类成分经过A 环开裂、D环再氧化开裂形成黄柏酮,通过成醚或成酯反应,A环和B环降解,D环开裂形成内酯生成降解型柠檬苦素类化合物梣酮;从而使其含量在各自组别中有所增加。萆薢作为一种常用中药,含有甾体、二芳基庚烷、木脂素类、有机酸等多种化学成分,具有抗肿瘤、抗骨质疏松、抗真菌、抗心肌缺血、降尿酸、调血脂等作用[12]。白鲜皮与萆薢配伍后,可使白鲜碱含量降低,这可能与萆薢中有机酸与白鲜皮中的生物碱成分发生反应有关。而桑螵蛸除主要含有蛋白质、脂肪和糖类化合物外,还有其他一些有效成分[13],至于是何者产生相恶作用,相关报道太少,还需进一步探究。

3 结语

本研究建立HPLC法同时测定白鲜碱、黄柏酮和梣酮的含量,仅从成分含量的角度考察了不同配伍比例白鲜皮四组相恶药对(桑螵蛸;茯苓;桔梗;萆薢)对白鲜皮中3种主要成分含量的影响,对其药对化学成分变化并未考察,后续还需从药效学等多个方面进一步研究,旨在为白鲜皮相恶药对的研究提供更详实的数据支持。