睾丸癌铁死亡相关基因的生物信息学分析

郭晓英， 李 玲， 马慧颖， 闫凤梅， 郝 羽， 黄 静， 宋宜岚

（1. 宁夏医科大学公共卫生学院职业卫生与环境卫生学系，银川 750004；2.宁夏医科大学环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004）

据WHO 报道，全球8%～12%的夫妇患有不育不孕症，其中男性因素占50%以上[1]。睾丸癌是20～35 岁人群最常见的肿瘤，约占95%，不育男性睾丸癌的患病率是正常男性的1.5 倍及以上[2-3]。目前为止，睾丸癌的主要治疗手段是放化疗，以延长患者的生存时间，但其对生育能力无治疗作用且可造成永久性不育[4]。因此，了解睾丸癌发生的具体分子机制，发现更加有效的预防和治疗方法尤为重要。

铁死亡作为近年来新发现的一种独特的细胞死亡方式[5]，越来越多地用于癌症相关治疗[6-7]。在肿瘤的发生过程中，铁死亡具有促进和抑制肿瘤的双重作用，且联合使用针对铁死亡信号的药物可以改善肿瘤的治疗效果[8-9]。本研究从基因水平探究睾丸癌铁死亡相关基因的差异表达模式，筛选与睾丸癌患者生存率相关的枢纽基因，以期为睾丸癌的预防、诊断和治疗提供新的思路和理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

从UCSC Xena 数据库（https://xena.ucsc.edu/）下载TCGA 数据（https://portal.gdc.cancer.gov/），从GTEx 数据库（https://genome.ucsc.edu/gtex.html）下载睾丸癌组织和正常组织表达谱数据；从美国基因芯片公共数据库GEO（gene expression omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载基因芯片GSE8607；从铁死亡数据库FerrDb V2（http：//www.zhounan.org/ferrdb/current/）下载铁死亡激动和抑制相关基因共483 个。

1.2 方法

1.2.1 睾丸癌组织与正常组织间主成分分析（principal component analysis，PCA）和差异基因筛选 从TCGA 和GTEx 数据库下载睾丸癌组织（n=148）和正常组织（n=165）表达谱数据，采用DESeq2 包[10]分析差异基因，差异基因筛选标准为adjustP＜0.05 且log2FC ＞2。从GEO 数据库下载GSE8607 基因芯片数据，利用limma 包[11]对正常组织（n=3）和睾丸癌组织（n=40）的表达谱数据进行差异表达分析，获得差异表达基因，筛选标准为adjustP＜0.05 且log2FC ＞1。采用FactoMineR[12]和Factoextra 包[13]对样本进行PCA分析。

1.2.2 睾丸癌铁死亡相关差异表达基因筛选及富集分析 将TCGA 和GTEx 数据库联合分析的睾丸癌差异表达基因与483 个铁死亡背景基因取交集基因，以获得睾丸癌铁死亡相关差异基因，经clusterProfilerR 包[14]进行功能注释分析，包括描述分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）和细胞成分（cellular component，CC）的基因本体（gene ontology，GO）分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。

1.2.3 蛋白互相作用（protein-protein interaction，PPI）分析和核心基因筛选 使用STRING 在线数据库和Cytoscape 软件的cytoHubba 包进行铁死亡相关的前10 个核心基因的筛选以及PPI 分析；用GEPIA 数据库对前10 个相关核心基因进行表达量分析。

1.2.4 GSE8607 基因芯片验证 从GSE8607 差异分析结果中提取出TCGA 和GTEx 联合分析的前10 个枢纽基因，对枢纽基因的表达谱通过pheatmap 包[15]绘制无监督聚类热图，验证TCGA和GTEx 联合分析核心基因的差异表达结果。

1.3 统计学方法

采用R 4.1.3 统计学软件进行差异分析、PCA 分析和聚类分析以及可视化。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异基因筛选和PCA 分析

PCA 散点图中反映PC1 和PC2 的主成分得分分别为30.3%和6.7%，累计解释基因表达变化的37.0%，且样本个数的点聚集在一起（图1A）。通过DESeq2 包对TCGA 和GTEx 数据进行分析获得7 349 个差异表达基因，其中5 232 个下调基因，2 117 个上调基因。将差异表达基因与483个铁死亡相关基因取交集获得69 个铁死亡差异表达基因。对GSE8607 芯片通过limma 包分析获得2 954 个差异表达基因，其中1 536 个下调基因，1 418 个上调基因。对样本进行PCA 分析发现，PC1 和PC2 的主成分得分分别为18.6%和13.8%，累计解释基因表达变化的32.4%（图1B）。

图1 睾丸癌和正常组织的PCA 分析

2.2 差异基因GO 和KEGG 富集分析

对69 个差异基因进行GO 富集分析，结果显示，BP 主要富集在氧化应激、化学应激、活性氧代谢过程等；CC 主要涉及细胞的黏着、细胞底物连接、线粒体外膜和细胞器外膜等；MF 主要富集在亚铁离子的结合、氧化还原酶活性，作用于过氧化物的受体、双加氧酶活性等功能（图2A）。KEGG 通路富集结果显示，主要富集在铁死亡相关通路、NOD 样受体信号通路、JAK-STAT 信号通路和胞质样受体信号通路（图2B）。

图2 铁死亡相关睾丸癌差异基因GO 和KEGG 富集

2.3 PPI 网络构建和核心基因筛选

将69 个铁死亡差异基因导入STRING 数据库，使用默认参数，构建PPI 网络（置信度＞0.4）（图3A）。将STRING 结果导入Cytoscape，通过cytoHubba 插件筛选出PPI 网络中度值（degree）最多的前10 个基因（TP53、IL-6、CD44、KRAS、HMOX1、PRDX1、SOX2、TXN、AR和GPX4）作为枢纽基因构建子网络（图3B）。

图3 铁死亡相关睾丸癌差异基因PPI 网络和前10 个核心基因

2.4 核心基因表达量分析

采用GEPIA 在线数据库分析前10 个核心基因表达量，与正常组织相比，睾丸癌患者中TP53、IL-6、CD44、KRAS、HMOX1、PRDX1、SOX2 和TXN基因高表达（P均＜0.01），AR和GPX4 基因低表达（P均＜0.01），见图4。

图4 前10 个铁死亡相关睾丸癌差异基因在睾丸癌与正常组织中的表达量

2.5 GSE8607 基因芯片验证

从GSE8607 差异分析结果中提取出TCGA和GTEx 联合分析的前10 个枢纽基因的表达谱数据，用pheatmap 包对枢纽基因的表达谱进行热图绘制（图5A）。结果显示，在GSE8607 基因芯片中TP53、IL-6、CD44、KRAS、HMOX1、PRDX1、SOX2 和TXN基因在睾丸癌组织中高表达，AR和GPX4 基因低表达，与TCGA 结果一致（图5B）。

图5 排名前10 位铁死亡相关睾丸癌差异基因表达热图

3 讨论

通过对睾丸癌生物标记物的研究，可对新的潜在的预后标记物和治疗靶标基因等进行探索。Zhu 等[16]通过建立睾丸癌的转移和复发预测模型，发现GRK4、PCYT2 和RGSL1 是睾丸癌的生存和治疗反应预测标记物。有研究[17]通过生物信息学分析发现长链非编码RNA RFPL3S 可作为睾丸癌的预后预测因子以及预测睾丸癌免疫治疗效果的标记物；研究[18]显示，在睾丸癌中MeCP2 的DNA 甲基化水平降低，与睾丸癌的预后、病理分期、分级和亚型相关。而癌症治疗中克服耐药性是重点也是难点。在铁死亡与癌症耐药性的研究中，诱导铁死亡已经被证明可以逆转耐药性[7]。本研究通过对睾丸癌转录数据的分析发现，在TCGA 联合GTEx 数据库中，睾丸癌组织和正常组织共表达的差异基因有7 349 个，其中5 232 个下调基因，2 117 个上调基因，与铁死亡相关差异基因有69 个。这些基因主要涉及氧化应激和线粒体功能等。在PPI 网络分析中，前10 个枢纽基因中，有8 个基因在睾丸癌组织中高表达，2 个基因低表达。在GSE8607 基因芯片中，前10 个枢纽基因同样在睾丸癌组织中表达一致，8 个高表达，2 个低表达，验证了TCGA 和GTEx 数据库的分析结果。

在铁死亡相关的睾丸癌差异基因的KEGG通路富集中，NOD 样受体通路和JAK-STAT 信号通路被激活，两者都是炎症和免疫相关的关键通路[19-21]。JAK-STAT 通路构成一个快速的膜到细胞核信号模块，并诱导癌症和炎症的各种关键介质的表达，且JAK-STAT 通路的失调与各种癌症和自身免疫性疾病有关[22-23]。NOD 样受体蛋白可介导对细胞损伤和应激的初始先天免疫反应，其与肿瘤的关系值得探究[24]。NLRs 的异常激活发生在各种癌症中，其可改变组织微环境，从而增加机体发生肿瘤的风险，通过药物阻断NLRs 炎性小体的激活和合成可能是预防癌症进展的有效方法之一[25]。睾丸癌的生存率与睾酮水平的高低相关[26]，与高睾酮水平的大鼠相比，低睾酮水平的大鼠中NLRP3、COX2、IL-1β 以及TNF-α 表达可显著上调[27]。因此，在睾丸癌治疗中，通过干预铁死亡来抑制NOD 样受体信号通路和JAKSTAT 信号通路可能是一种潜在治疗方式。

在对枢纽基因的筛选中，TP53 和IL-6 评分最高，说明其在睾丸癌差异基因的调控中发挥的作用最大。TP53 和IL-6 是铁死亡的关键调控基因[28-29]，GEPIA 基因的表达量结果同样显示，TP53和IL-6 在睾丸癌组织中的表达量上升。而与正常组织相比，AR和GPX4 在睾丸癌组织中表达量下降，AR表达的激活可促进GPX4 的表达来抑制活性氧的产生和升高，从而抑制铁死亡的发生[30-32]。

因此，本研究通过对睾丸癌基因的生物信息学分析发现，NLRs 通路和JAK-STAT 通路可作为联合铁死亡治疗睾丸癌的靶向调节通路，TP53、IL-6、AR 和GPX4 可作为联合铁死亡治疗睾丸癌药物的靶标及预测睾丸癌患者生存率的肿瘤标记物。因此，本研究为睾丸癌的发生、发展、治疗及预后机制的研究提供了一定的思路。