H2O2 诱导小鼠睾丸间质TM3 细胞铁死亡模型的构建

王 佳， 马丽媛， 母春兰， 刘春莲， 焦海燕

（1.宁夏医科大学教育部生育力保持重点实验室，银川 750004； 2.宁夏医科大学基础医学院医学遗传学与细胞生物学系，银川 750004； 3. 宁夏医科大学总医院生殖中心，银川 750004）

近年来，不育已成为世界范围内的重要健康问题之一。近50%的不育与男性因素有关[1]，而活性氧（reactive oxygen species，ROS）介导的睾丸组织损伤是其主要原因[2]。睾丸组织细胞质膜中丰富的多不饱和脂肪酸易受ROS 攻击[3-4]。当机体内过量的ROS 打破氧化-抗氧化平衡时，则会发生氧化应激（oxidative stress，OS）。目前研究[5]发现，由ROS 导致的脂质过氧化物（lipid peroxide，LPO）积累是引发铁死亡的关键因素。铁死亡是一种铁依赖的LPO 积累引起的调节性细胞死亡。不同于其他的细胞死亡形式，当发生铁死亡时，细胞内Fe2+浓度升高，LPO 水平增加，谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）活性降低[6]，线粒体萎缩，膜密度增大，嵴减少或消失[7]。有研究[8-9]显示，男性不育患者精子中ROS 积累、GPX4 活性降低，推测OS 导致的生殖损伤与铁死亡有关，但目前尚缺乏直接证据，且缺乏用于相关研究的细胞模型。因H2O2极易透过细胞膜，可与细胞内的Fe2+通过Fenton 反应使细胞产生大量ROS 和丙二醛（malondialdehyde，MDA）[10]，常被用于诱导细胞产生OS。本研究拟用H2O2诱导小鼠睾丸间质TM3 细胞建立铁死亡细胞模型，研究结果将为进一步研究铁死亡对生殖细胞的影响及抗氧化药物对雄性生殖细胞的保护作用及机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠睾丸间质TM3 细胞购于中国科学院上海细胞库（北纳公司代理）；全蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、MDA 试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒与ROS检测试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司；LPO 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；DMSO 购自美国Sigma 公司；50%H2O2购自四川金山制药有限公司；青链霉素购自Solarbio 公司；FBS 胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco 公司；DMEM 培养基购自Hyclone 公司；无水乙醇购自生工生物工程（上海）股份有限公司；GSH 过氧化物酶4 抑制剂（RSL3）与铁死亡蛋白抑制剂（iFSP1）购自MCE 公司；Phen-Green-SK（25393）荧光探针购自Cayman 公司；MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 TM3 细胞复苏后，使用含10%胎牛血清的DMEM 培养基于37 ℃、5%CO2的培养箱内培养。根据细胞生长情况换液，待细胞长至80%～90%时，弃原液，用PBS 缓冲液冲洗，加入0.05%胰蛋白酶进行消化，后加入培养基终止消化，以1∶3 进行传代处理，补足培养液，混匀，置于细胞培养箱中常规培养。

1.2.2 H2O2处理及细胞活力检测 将细胞按5×105个/mL 浓度接种于96 孔板，100 μL/孔，复孔3 个，置于细胞培养箱中培养；待细胞密度长至60%～70%时，向96 孔板中加入含不同H2O2浓度（0、1、2 mmol·L-1）的培养液，分别培养1 h。按上述方法进行铺板及培养，继续培养1 h，向96 孔板中分别加入MTS 20 μL /孔，置于细胞培养箱中继续培养2 h；取出96 孔板，在酶标仪490 nm波长下检测各孔吸光度（OD）值。

1.2.3 OS 特征指标测定 实验分组为TM3 细胞常规培养组（T 组）和2 mmol·L-1H2O2处理TM3 细胞1 h 组（H2O2-T 组）。各组细胞去上清液，分别加入DCFH-DA 稀释液（按1∶500 用无血清培养基稀释），洗涤，消化收集细胞，500 μL PBS 重悬细胞后，流式细胞仪检测细胞内ROS 生成情况。将细胞用PBS 重悬，加入全蛋白裂解液，在冰浴条件下超声破碎，离心取上清液，获得蛋白原液。使用BCA 法检测并计算待测样本蛋白浓度。按照MDA 试剂盒说明书分别设置空白管、标准管、测定管与对照管，并按要求分别进行加样，95 ℃水浴40 min 后冷却并离心取上清液，在532 nm 处检测OD 值并按照公式计算MDA 含量。组织中MDA 含量（nmol·mgprot-1）=（OD测定-OD对照）/（OD标准-OD空白）×标准品浓度（10 nmol·mL-1）÷待测样本蛋白浓度（mgprot·mL-1）。使用SOD 测定试剂盒，分别设置对照孔、对照空白孔、测定孔和测定空白孔。按一定比例稀释待测蛋白原液，并根据说明书进行加样，37 ℃孵育20 min，在波长450 nm 处检测OD 值，并根据公式计算SOD 抑制率，按照定义，在该反应体系中SOD 抑制率达50%时所对应的酶量为一个SOD 活力单位。最后得出SOD 活性。SOD 抑制率（%）=［（A对照-A对照空白）-（A测定-A测定空白）］/（A对照-A对照空白）×100%；SOD 活性（U·mgprot-1）=SOD 抑制率÷50%×反应体系稀释倍数（0.24 mL/0.02 mL）÷待测样本蛋白浓度（mgprot·mL-1）。

1.2.4 LPO 水平测定 设置分组为T 组；H2O2-T组；1 μmol·L-1RSL3 处 理TM3 细 胞1 h 组（RSL3-T 组）；3 μmol·L-1iFSP1 处理TM3 细胞24 h 组（iFSP1-T 组）。按1.2.3 中方法提取细胞蛋白原液，并采用BCA 法测定蛋白浓度。使用LPO检测试剂盒，分别设置空白管、标准管和测定管，按照说明书加样，混匀后于45 ℃孵育60 min，离心后取上清，在586 nm 波长处测定OD 值，并根据公式计算LPO 含量。LPO 含量（μmol·gprot-1）=（A测定-A测定空白）/（A标准-A空白）×标准品浓度（10 μmol·L-1）÷待测样本蛋白浓度（gprot·mL-1）。1.2.5 细胞铁含量的测定 实验按照1.2.4 进行分组。PBS 重悬细胞后，加入Phen-Green-SK 10 μmol·L-1，37 ℃避光孵育10 min，PBS 洗涤后重悬细胞，4%多聚甲醛固定细胞10 min，使用Hoechst 33342 孵育细胞5 min，弃去染液，使用激光共聚焦显微镜进行观察。激光共聚焦观察时选择波长488 nm，观察到绿色荧光。

1.2.6 线粒体超微结构观察 实验按照1.2.4进行分组。将细胞离心去上清后加固定液。用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液漂洗3 次，2%锇酸固定后再次用磷酸缓冲液冲洗。冲洗后的样本经过脱水、渗透、包埋，通过超薄切片机定位切片，使用2%醋酸铀-柠檬酸铅双染色后，通过透射电镜观察、拍片。

1.3 统计学方法

应用GraphPad Prism 8.0 软件对实验数据进行作图及统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用Dunnett-t检验，各独立实验均重复3次。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度H2O2 对TM3 细胞活力的影响

用0、1、2 mmol·L-1的H2O2分别处理TM3 细胞1 h，与0 mmol·L-1相比，用1、2 mmol·L-1H2O2处理后的细胞活力均降低（P均＜0.01），通过计算，IC50为2 mmol·L-1，见图1。因此，本研究选择2 mmol·L-1H2O2作用1 h 构建H2O2诱导TM3 细胞铁死亡细胞模型。

图1 不同H2O2 浓度对TM3 细胞活力的影响

2.2 H2O2 对TM3 细胞氧化水平的影响

与T 组相比，H2O2-T 组ROS 水平、MDA 含量均上升（P均＜0.001），SOD 活性下降（P＜0.001），见图2。

图2 H2O2 对TM3 细胞ROS、MDA 及SOD 水平的影响

2.3 H2O2 对TM3 细胞LPO 含量的影响

与T 组相比，H2O2-T 组、RSL3-T 组与iFSP1-T组LPO 含量均升高（P均＜0.001），见图3。

图3 H2O2 对TM3 细胞LPO 含量的影响

2.4 H2O2 对TM3 细胞内铁离子含量的影响

与T 组相比，H2O2-T 组、RSL3-T 组与iFSP1-T组荧光强度均减弱（P均＜0.001），见图4。同RSL3-T 组与iFSP1-T 组相比，H2O2-T 组荧光强度变化，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

图4 H2O2 对TM3 细胞内铁离子含量的影响

2.5 H2O2 对TM3 细胞线粒体形态的影响

透射电镜结果显示，T 组细胞线粒体结构完整，形态饱满，线粒体嵴清晰明显；而H2O2-T 组、RSL3-T 组与iFSP1-T 组细胞线粒体均出现类似的形态变化。H2O2-T 组细胞线粒体发生皱缩变小、嵴减少、外膜破裂的现象。RSL3-T 组与iFSP1-T 组细胞线粒体也明显变小，嵴减少或消失，部分线粒体外膜破裂，见图5。

图5 透射电镜观察不同药物处理下TM3 细胞线粒体超微结构变化（bar=1 μm）

3 讨论

铁死亡是一种铁依赖的LPO 积累引起的非凋亡形式的调节性细胞死亡[5]。铁死亡的发生是细胞内脂质ROS 生成与降解的平衡失调所致。H2O2是一种分子质量较小的ROS，极易通过细胞膜，可与细胞中不稳定铁池中游离的Fe2+发生Fenton 反应，产生高活性的羟基自由基，促使ROS 积累及膜脂过氧化[11-13]，导致LPO 积累。MDA是脂质过氧化最丰富的副产品之一，也是OS 的常用生物标记物。MDA 可通过传播和放大氧化损伤，加速细胞死亡[14]。SOD 是生物体内的一种抗氧化金属酶，可清除氧自由基，被用于评估机体抗氧化能力。当羟基自由基过多，就会导致磷脂的过度氧化，MDA 含量上升，SOD 活性下降[15]。LPO 浓度的增加引起膜不稳定性，甚至破裂，产生其他有毒性衍生物，最终导致细胞铁死亡[16]。本研究使用H2O2处理TM3 细胞后，ROS、MDA和LPO 水平均升高，SOD 活性降低。表明细胞在高水平ROS 作用下，脂质过氧化水平升高，抗氧化能力降低，可能引发铁死亡。

铁死亡是铁离子依赖的细胞死亡。本研究结果显示，用H2O2、RSL3 与iFSP1 分别处理细胞后，细胞内Fe2+含量较对照组均升高。RSL3 是一种靶向GPX4 的铁死亡诱导剂[17-18]，可诱导细胞内ROS 升高、LPO 增加而发生铁死亡。铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，FSP1）具有脂质抗氧化剂的作用，对GPX4 缺失引起的铁死亡有保护作用，iFSP1 可诱导铁死亡的发生[19]。本研究中，H2O2处理组同RSL3 与iFSP1 分别诱导的铁死亡阳性细胞组相比，Fe2+含量差异无统计学意义，表明H2O2干预组细胞Fe2+含量升高趋势同铁死亡诱导剂组一致，提示H2O2干预组细胞发生铁死亡。铁死亡的主要形态学特征是细胞中线粒体变小，线粒体膜密度增高，线粒体嵴减少或消失，外膜破裂[7]。本研究结果显示，用H2O2、RSL3 与iFSP1 分别处理细胞后，线粒体均明显变小，嵴减少或消失，部分线粒体外膜破裂，提示H2O2诱导了铁死亡。

综上所述，本研究利用H2O2干预小鼠睾丸间质TM3 细胞成功诱导OS 后，细胞呈现ROS、MDA、LPO 及Fe2+含量升高、线粒体变小皱缩、嵴减少或消失、外膜破裂等铁死亡特征。提示H2O2诱导小鼠TM3 细胞铁死亡模型构建成功。